殼寡糖及其溴絡(luò)合物的抗菌活性研究

馮文娟，馬韻升，徐澤平，3 *，劉結(jié)磊，孫建忠

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.山東京博控股股份有限公司，山東 濱州 256500；3.濱州市環(huán)境微生物技術(shù)工程研究中心，山東 濱州 256500）

殼寡糖（oligochitosan）也叫低聚殼聚糖、殼聚寡糖、寡聚氨基葡糖，是殼聚糖經(jīng)過特殊的生物酶技術(shù)[1]、化學(xué)降解技術(shù)或微波降解技術(shù)等降解得到的一種聚合度在2～20之間的低分子質(zhì)量殼聚糖，分子質(zhì)量一般≤3 200 u，是自然界中唯一帶正電荷陽離子堿性氨基低聚糖[2]。它已經(jīng)作為一種生物保鮮劑[3-5]、飼料添加劑[6]、新型生物農(nóng)藥[7]而被廣泛應(yīng)用。殼寡糖溴絡(luò)合物是由殼寡糖與單體溴發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)獲得的。目前，有不少學(xué)者對殼聚糖及其碘絡(luò)合物的抑菌[8-13]和殼寡糖的抑菌抗菌[14]、抗病毒[15]、抗腫瘤[16]進行了研究，其中，王少南等[17]用氨基寡糖500倍液噴施黃瓜幼苗，抑制黃瓜枯萎病的誘導(dǎo)活性提高59.6%。殼寡糖溴絡(luò)合物抗菌活性研究少見報道。該研究采用了培養(yǎng)基稀釋法和平板計數(shù)法，通過微生物在不同濃度殼寡糖及其溴絡(luò)合物的平板上的生長量，確定殼寡糖及其溴絡(luò)合物對微生物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），通過MIC和MBC來表征殼寡糖及其溴絡(luò)合物對大腸桿菌、白色念珠菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性，為新型高效抗菌劑的研制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼寡糖、殼寡糖溴絡(luò)合物、大腸桿菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：由黃河三角洲京博化工研究院有限公司工業(yè)生物研究所提供，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

LB液體培養(yǎng)基：氯化鈉1%、胰蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%，pH 7.0～7.2。LB固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%的瓊脂粉。用于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2%、酵母浸粉1%、蛋白胨2%，pH自然。YPD固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂粉。用于白色念珠菌的培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

W-CJ-1D型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ-R搖床：常州諾基儀器有限公司；250B生化培養(yǎng)箱：金壇市中大儀器廠；0.22 μm濾膜：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；FA2004型電子天平、PHS-3C型精密pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-1700型紫外可見分光光度計：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 殼寡糖分子質(zhì)量的測定

采用乙酰丙酮法測定[18]。

1.3.2 菌種的活化

在無菌條件下，將保藏在試管斜面的受試菌種接種到液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，150 r/min轉(zhuǎn)速的搖床上活化24 h，備用。

1.3.3 菌種的培養(yǎng)

在無菌條件下，將活化好的菌種轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，接種量為5%，在37 ℃，150 r/min轉(zhuǎn)速的搖床上培養(yǎng)24 h，備用。

1.3.4 MIC和MBC的測定

分別配制質(zhì)量濃度為125 mg/mL的殼寡糖及其溴絡(luò)合物的溶液，用注射器吸取后過0.22 μm的無菌膜，10 mL無菌小瓶收集備用。在無菌環(huán)境下，分別取一定量的殼寡糖及其溴絡(luò)合物溶液添加到裝有50 mL固體培養(yǎng)基的三角瓶中，使殼寡糖及其溴絡(luò)合物的質(zhì)量濃度為0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L、4.0 g/L、5.0 g/L、6.0 g/L、6.5 g/L、7.0 g/L、7.5 g/L、8.0 g/L、8.5 g/L，充分振蕩均勻后，倒3個平板，并做好標(biāo)記，以不加殼寡糖及其溴絡(luò)合物的固體培養(yǎng)基作為空白對照培養(yǎng)基。菌液按照10倍梯度稀釋法稀釋5個梯度，取稀釋10萬倍的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌菌懸濁液100 μL均勻混在40～50 ℃的固體培養(yǎng)基平板中；而由于白色念珠菌為好氧菌，待平板中的YPD固體培養(yǎng)凝固后，將白色念珠菌均勻的涂布在培養(yǎng)基上，37 ℃下倒立放置培養(yǎng)，分別在24 h、48 h后計數(shù)?？瞻讓φ战M為未添加殼寡糖及其溴絡(luò)合物。在空白對照組菌落生長良好的情況下，24 h后無菌落生長的最低藥物劑量為最小抑菌濃度（MIC），48 h后無菌落生長的最低藥物劑量為最小殺菌濃度（MBC）。

1.3.5 殼寡糖的結(jié)構(gòu)及其分子質(zhì)量

殼寡糖的化學(xué)名稱為β-（1,4）-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖，分子式為（C6H11NO4）n（n=2～20），其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

本試驗所用的殼寡糖分子質(zhì)量為2 800 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 對大腸桿菌的抑制

殼寡糖及其溴絡(luò)合物對大腸桿菌的抑菌結(jié)果如表1所示，殼寡糖對大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為6.5 g/L。殼寡糖溴絡(luò)合物對大腸桿菌的最小抑菌濃度為1.0 g/L，最小殺菌濃度為1.2 g/L。說明了與殼寡糖相比，殼寡糖溴絡(luò)合物對大腸桿菌的抑菌和殺菌效果更好。

表1 殼寡糖及其溴絡(luò)合物對大腸桿菌的抑菌效果Table 1 The inhibitory effect of oligochitosan and its bromide complexes on Escherichia coli

2.2 對白色念珠菌的抑制

殼寡糖及其溴絡(luò)合物對白色念珠菌的抑菌結(jié)果如表2所示，殼寡糖對白色念珠菌的最小抑菌濃度為4.0 g/L，最小殺菌濃度為8.0 g/L。殼寡糖溴絡(luò)合物對白色念珠菌的最小抑菌濃度為1.5 g/L，最小殺菌濃度為2.0 g/L。說明了與殼寡糖相比，殼寡糖溴絡(luò)合物對白色念珠菌的抑菌和殺菌效果更好。

表2 殼寡糖及其溴絡(luò)合物對白色念珠菌的抑菌效果Table 2 The inhibitory effect of oligochitosan and its bromide complexes on Candida albicans

2.3 對枯草芽孢桿菌的抑制

殼寡糖及其溴絡(luò)合物對枯草芽孢桿菌的抑菌結(jié)果如表3所示，殼寡糖對枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為1.5 g/L。殼寡糖溴絡(luò)合物對枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為1.0 g/L，最小殺菌濃度為1.5 g/L。說明了殼寡糖溴絡(luò)合物和殼寡糖對枯草芽孢桿菌的殺菌效果相同，而殼寡糖溴絡(luò)合物的抑菌效果更好。

表3 殼寡糖及其溴絡(luò)合物對枯草芽孢桿菌的抑菌效果Table 3 The inhibitory effect of oligochitosan and its bromide complexes on Bacillus subtilis

3 結(jié)論

殼寡糖是一種天然、無毒、水溶性好、可生物降解的化合物，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品等多個領(lǐng)域。普遍認為，殼寡糖的抑菌活性是由于氨基質(zhì)子化帶正電引起的[19]。殼寡糖溴絡(luò)合物具有良好的水溶性，其抑菌機理未見報道。通過實驗結(jié)果得出：殼寡糖對大腸桿菌的MIC和MBC均為6.5 g/L；對白色念珠菌的MIC為4.0 g/L，MBC為8.0 g/L；對枯草芽孢桿菌的MIC和MBC均為1.5 g/L。殼寡糖溴絡(luò)合物對大腸桿菌的MIC為1.0 g/L，MBC 為1.2 g/L；對白色念珠菌的MIC為1.5 g/L，MBC為2.0 g/L；對枯草芽孢桿菌的MIC為1.0 g/L，MBC為1.5 g/L。殼寡糖對大腸桿菌、白色念珠菌和枯草芽孢桿菌具有良好的抑菌活性，殼寡糖溴絡(luò)合物對其抑菌活性更好，為殼寡糖及其溴絡(luò)合物在新型綠色生物農(nóng)藥的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。本研究下一步將對殼寡糖溴絡(luò)合物的制備工藝及結(jié)構(gòu)鑒定、抑制真菌、抑菌機理進行研究，為其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。

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