發(fā)酵型茯苓葡萄酒的研制及品質(zhì)評(píng)價(jià)

崔培梧，曹 婧，米 潔，陳 林，廖 彥，譚朝陽*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.墊江縣中醫(yī)院，重慶 408300；3.西安交通大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 西安 710049）

茯苓（Poria cocos）是重要的藥食同源菌物，其味甘性平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕、健脾寧心之功效，在臨床中藥配伍及中成藥生產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛[1-2]；同時(shí)相關(guān)研究已證明茯苓主要活性成分為多糖和三萜類化合物，且二者均具有顯著的抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、保肝、降低移植手術(shù)后受體排斥反應(yīng)等功能[3-5]，因此茯苓保健品的研發(fā)備受關(guān)注，目前已有茯苓多糖口服液、茯苓餅干、茯苓面膜等問世。果酒是指以新鮮水果為原料，在保存水果原有營(yíng)養(yǎng)成分的前提下通過酵母分解糖分而釀造出的具有保護(hù)心肌、軟化血管、美容、促進(jìn)消化等多重保健功效的營(yíng)養(yǎng)酒飲，其中以葡萄酒最為著名[6]。因此，如能結(jié)合傳統(tǒng)葡萄酒釀造工藝，研制具有特殊保健功能的發(fā)酵型茯苓葡萄酒，不失為茯苓保健品的一種新形式，雖然王謙等[7]也對(duì)茯苓發(fā)酵酒的釀造工藝，同時(shí)通過工藝優(yōu)化獲得色澤金黃、酒香純正的茯苓發(fā)酵酒，但由于在釀酒原料中僅補(bǔ)充蔗糖，自然也就喪失了葡萄酒特有的風(fēng)味和口感，而葡萄酒釀造過程中抑菌、防氧化等特殊處理措施又非常關(guān)鍵，故探索發(fā)酵型茯苓葡萄酒的釀造工藝仍非常必要。

因此本研究擬結(jié)合傳統(tǒng)葡萄酒釀造工藝，首先以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵過程優(yōu)化[8]和工藝設(shè)計(jì)[9]等過程中的Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)影響發(fā)酵型茯苓葡萄酒釀造質(zhì)量的初始糖度、接種量、發(fā)酵溫度、偏重亞硫酸鉀添加量4個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，擬探討在發(fā)酵體系中添加茯苓發(fā)酵液的發(fā)酵型葡萄酒釀制工藝，并對(duì)所得茯苓葡萄酒的感官品質(zhì)及理化、衛(wèi)生指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，以期開發(fā)既具有多重保健功效、又不失口感、營(yíng)養(yǎng)的新型茯苓葡萄酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓菌（Poria cocos）JZ由湖南靖州茯苓栽培基地提供并保藏于湖南中醫(yī)藥大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室。葡萄：當(dāng)?shù)爻?，要求新鮮、籽粒飽滿、無霉變、漿果。葡萄酒/果酒專用酵母菌：安琪酵母股份有限公司；熊果酸（純度≥98%）：中國(guó)藥品生物制品檢定所；葡萄糖、蔗糖、偏重亞硫酸鉀、殼聚糖等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

泰斯特MJX-250BX型培養(yǎng)箱：廣州滬瑞明儀器有限公司；SKY-211D型恒溫空氣浴搖床、BLBIO-10SJ型生物反應(yīng)器：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；520型板框壓濾機(jī)：滄州亞龍壓濾機(jī)有限公司；UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津公司；PHB-4型便攜式pH酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠；BK-8480酒精計(jì)：北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司；ATAGO PAL-α數(shù)字糖度計(jì)：日本愛宕公司。

1.3 方法

1.3.1 茯苓發(fā)酵液的制備

茯苓發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g、蛋白胨7.5 g、硝酸鉀7.5 g、維生素B10.005 g，水1 000 mL，初始pH值5.5，配好后于121 ℃滅菌20 min。

茯苓菌種的制備：取保藏的茯苓菌種，轉(zhuǎn)接至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）平板在28 ℃下培養(yǎng)5 d，然后轉(zhuǎn)接至裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，作為二級(jí)菌種。

茯苓菌的放大培養(yǎng)：在10 L反應(yīng)器中裝入7.2 L發(fā)酵培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌20 min后，接種10%（V/V）的二級(jí)種子，于28 ℃、300 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，收集發(fā)酵液，板框壓濾得茯苓發(fā)酵液，經(jīng)115 ℃條件下滅菌15 min，冷卻、備用。

1.3.2 茯苓葡萄酒的制備

酵母菌的活化：在35～40 ℃含2%蔗糖的溫水中加入10%（W/V）安琪葡萄酒活性干酵母粉，混勻，靜置使之復(fù)水、活化，每隔10 min輕輕攪拌一次，共活化20～30 min。

茯苓葡萄酒的釀造工藝流程：

葡萄→篩選、洗滌、自然晾干→組織破碎→與茯苓發(fā)酵液以1 000 g/L進(jìn)行混合，裝入發(fā)酵缸（添加適量的蔗糖、偏重亞硫酸鉀、酵母菌種）→主發(fā)酵（溫度設(shè)置參考實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，7 d）→皮渣分離，酒液轉(zhuǎn)至發(fā)酵缸→后發(fā)酵（20 ℃、20 d）→添加0.02%（V/V）10 g/L殼聚糖溶液→混勻、靜置澄清（15 ℃、48 h）→巴氏消毒（85 ℃、15 min）→茯苓葡萄酒

1.3.3 茯苓葡萄酒釀造工藝條件的確定

在固定好其他條件不變的前提下，以茯苓葡萄酒酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察不同初始糖度（150 g/L、175 g/L、200 g/L、225 g/L、250 g/L）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、主發(fā)酵溫度（20.0 ℃、22.5 ℃、25.0 ℃、27.5 ℃、30.0 ℃）、偏重亞硫酸鉀添加量（0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L）對(duì)最終茯苓葡萄酒酒精度的影響，進(jìn)而采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)該4個(gè)因素的綜合影響效應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳茯苓葡萄酒發(fā)酵工藝，并對(duì)所得茯苓葡萄酒的品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.3.4 理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)的測(cè)定

糖度、酸度和酒精度的測(cè)定分別參照國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法測(cè)定；多糖的測(cè)定采用硫酸-苯酚法[10]；三萜的測(cè)定采用香草醛-高氯酸比色法[11]；微生物指標(biāo)的測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB 4789.1—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》中的方法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、致病菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始糖度對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵的影響

可發(fā)酵糖為酵母合成乙醇的重要底物，初始糖含量的高低直接影響著乙醇的產(chǎn)率，進(jìn)而影響到成品酒的品質(zhì)和口感。初始糖唐對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 初始糖度對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on Poria cocos wine fermentation

由圖1可知，初始糖度對(duì)茯苓葡萄酒的pH影響較小，pH值基本維持在3.39～3.80，在初始糖度為225 g/L時(shí)，酒精度達(dá)到最高，為11.9%vol，殘?zhí)呛繛?1 g/L，也有明顯增加，推理其原因可能是因?yàn)榫凭鹊脑黾訉?duì)酵母菌的糖酵解產(chǎn)生了一定的抑制作用，所以在初始糖度提高到250 g/L時(shí)茯苓葡萄酒的酒精度并沒有繼續(xù)增加，反而造成了殘?zhí)呛康纳?，因此選擇225 g/L作為最佳初始糖度。

2.2 酵母接種量對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵的影響

果酒發(fā)酵過程中酵母的代謝分為細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇積累兩個(gè)階段，其中接種量是影響著酵母細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)短的關(guān)鍵因素，代謝周期過長(zhǎng)會(huì)增加雜菌污染的概率，而接種量過大又會(huì)造成發(fā)酵糖的過度消耗，進(jìn)而影響乙醇產(chǎn)率。酵母接種量對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 酵母接種量對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of inoculum on Poria cocos wine fermentation

由圖2可知，酵母接種量為3%時(shí)茯苓葡萄酒酒精度和殘?zhí)呛孔畲?，此時(shí)酒精度為11.1%vol，殘?zhí)呛繛?1 g/L，酒液pH值為3.55，酵母接種量過高或過低均會(huì)引起酒精度和殘?zhí)呛康南陆担f明接種量過低使得酵母細(xì)胞生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，相應(yīng)的細(xì)胞維持代謝消耗糖量增加，而過高的接種量又會(huì)增加了細(xì)胞進(jìn)行有氧代謝的底物消耗，因此選擇3%作為最佳酵母接種量。

2.3 主發(fā)酵溫度對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵的影響

果酒釀造過程中，溫度控制對(duì)酵母活性、酚類物質(zhì)浸出、揮發(fā)性香氣物質(zhì)的形成及保留具有重要影響，發(fā)酵溫度過低會(huì)影響細(xì)胞代謝速率，而過高的溫度又會(huì)使得細(xì)胞致死，增加高級(jí)醇、揮發(fā)酸等不良風(fēng)味物質(zhì)的形成[12-13]，主發(fā)酵溫度對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 主發(fā)酵溫度對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of main fermentation temperature on Poria cocos wine fermentation

由圖3可知，當(dāng)主發(fā)酵溫度為27.5 ℃時(shí)，酒精度最高，為11.8%vol，殘?zhí)呛肯鄬?duì)較低，為49 g/L，pH值為3.59，過低或過高的溫度控制均會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞的糖酵解代謝產(chǎn)生抑制作用，其原因可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程中傳熱的滯后效應(yīng)使得細(xì)胞的代謝熱不能及時(shí)排除，進(jìn)而產(chǎn)生毒性，同時(shí)低溫又限制了代謝速率，因此選擇27.5 ℃作為最佳主發(fā)酵溫度。

2.4 偏重亞硫酸鉀添加量對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵的影響

果酒最主要的特色在于其風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，生產(chǎn)過程添加二氧化硫可抑制不良微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)果酒的澄清、抗氧化、增酸、增溶等效果[14-15]，通常以亞硫酸和亞硫酸鹽的形式添加在主發(fā)酵前一次性添加，以實(shí)現(xiàn)二氧化硫的緩慢釋放。因此，分別考察了0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L偏重亞硫酸鉀對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 偏重亞硫酸鉀添加量對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of potassium metabisulphate addition on Poria cocos wine fermentation

由圖4可知，當(dāng)偏重亞硫酸鉀添加量為100 mg/L時(shí)，茯苓葡萄酒酒精度達(dá)到最高，為10.9%vol，可以達(dá)到較好的發(fā)酵效果，此時(shí)殘?zhí)呛繛?2 g/L，pH值為3.59。偏重亞硫酸鉀添加量繼續(xù)增加并不會(huì)引起酒精度等指標(biāo)的顯著變化，但卻引起二氧化硫殘留的增加，而較低偏重亞硫酸鉀添加量會(huì)增加發(fā)酵體系的染菌風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)與空白組相比，偏重亞硫酸鉀對(duì)于酵母細(xì)胞乙醇的合成過程也有一定的調(diào)控作用，因此選擇100 mg/L作為偏重亞硫酸鉀的最佳添加量。

2.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化茯苓葡萄酒的發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以成品茯苓葡萄酒酒精度（Y）為響應(yīng)值，選取初始糖度（X1）、酵母接種量（X2）、主發(fā)酵溫度（X3）、偏重亞硫酸鉀添加量（X4）作為自變量，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

采用Design Expert 8.05軟件對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立多元二次回歸方程如下：

為驗(yàn)證該模型的可信度，對(duì)所得模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2所示。

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of Box-Behnken experiment

由表2方差分析可知，模型P＜0.05，該回歸模型達(dá)到顯著水平。模型中的X2、X3、X4、X12、X22、X32、X42對(duì)響應(yīng)變量的影響均具有顯著性，而X1、X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4不顯著，這表明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。同時(shí)交互項(xiàng)均不顯著說明任意兩因素間不存在交互作用，模型失擬項(xiàng)不顯著，說明模型擬合度良好，此模型可以用來對(duì)茯苓葡萄酒的發(fā)酵效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。為進(jìn)一步直觀分析響應(yīng)面優(yōu)化效果，根據(jù)回歸模型繪制相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖見圖5。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

圖5 初始糖度、接種量、發(fā)酵溫度和偏重亞硫酸鉀添加量交互作用對(duì)茯苓葡萄酒發(fā)酵影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of interaction of effects of initial sugar content,inoculum,main fermentation temperature,and potassium metabisulphate on Poria cocos wine fermentation

由圖5可知，對(duì)于任意兩個(gè)因素，響應(yīng)變量均存在極大值。結(jié)合所見二次模型，對(duì)該極大值進(jìn)行求解，得出最優(yōu)變量組合為初始糖度225.56 g/L、酵母接種量3.4%、主發(fā)酵溫度27.23 ℃、偏重亞硫酸鉀添加量89.26 mg/L，此時(shí)茯苓葡萄酒理論酒精度為13.67%vol。

為驗(yàn)證所建模型預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，依據(jù)最優(yōu)變量組合進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示酒精度為（13.72±0.29）%vol，實(shí)際值與理論值偏離＜5%，說明所建模型有效。故茯苓葡萄酒主發(fā)酵的最優(yōu)條件為：初始糖度225.56 g/L、酵母接種量3.4%、主發(fā)酵溫度27.23℃、偏重亞硫酸鉀添加量89.26 mg/L。

2.6 發(fā)酵型茯苓葡萄酒品質(zhì)分析

在最佳工藝條件下制作發(fā)酵型茯苓葡萄酒，并對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià)。

感官指標(biāo)：茯苓葡萄酒呈現(xiàn)紅褐色或棗紅色澤，富含葡萄及茯苓發(fā)酵液特殊香味，口味純正，酸甜可口，酒體澄清透明、無懸浮物、無沉淀。

理化指標(biāo)：酒精度為13.72%vol，pH值為3.52，殘?zhí)呛繛?2.1g/L，茯苓多糖含量為6.2g/L，茯苓三萜含量0.44g/L。

微生物指標(biāo)：細(xì)菌總數(shù)≤50 個(gè)/mL、大腸桿菌總數(shù)≤3 MPN/100 mL、致病菌未檢出，符合國(guó)標(biāo)GB 2758—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵酒及其配制酒》。

3 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析了初始糖度、酵母接種量、主發(fā)酵溫度、偏重亞硫酸鉀添加量對(duì)發(fā)酵型茯苓葡萄酒的發(fā)酵效果影響，在此基礎(chǔ)上采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)主發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合所建二次模型獲得最佳發(fā)酵條件：初始糖度225.56 g/L、接種量3.4%、發(fā)酵溫度27.23 ℃、偏重亞硫酸鉀添加量89.26 mg/L。經(jīng)驗(yàn)證，所建模型可以較好擬合實(shí)際數(shù)據(jù)，同時(shí)感官評(píng)價(jià)、理化及微生物指標(biāo)檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示所得茯苓葡萄酒符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。這與傳統(tǒng)果酒和泡制藥酒相比既改善了口感、風(fēng)味，又強(qiáng)化了果酒的保健功能，為發(fā)酵型保健果酒的研制提供了參考。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2]趙英博，徐 斌，昝俊峰，等.不同產(chǎn)地茯苓中茯苓酸含量的比較研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2009，16（7）：41-42.

[3]RIOS J L.Chemical constituents and pharmacological properties of Poria cocos[J].Planta Med,2011,77(7):681-691.

[4]WANG Y Z,LI T,ZHAO Y L,et al.Contents of some metabolites in the peel and flesh of the medicinal mushroomWolfiporia cocos(F.A.Wolf)Ryvarden et Gilb.(higher Basidiomycetes).[J].Int J Med Mushrooms,2012,14(1):79-83.

[5]XU Z Y,TANG W R,XIONG B,et al.Effect of revulsive cultivation on the yield and quality of newly formed sclerotia in medicalWolfiporia cocos[J].J Nat Med,2014,68(3):576-585.

[6]邵志芳.葡萄酒品質(zhì)分析方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2015，34（4）：17-20.

[7]王 謙，宋桂慶.茯苓酒發(fā)酵工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（11）：3-6.

[8]YANG F F,LONG L J,SUN X M,et al.Optimization of medium using response surface methodology for lipid production byScenedesmussp.[J].Mar Drugs,2014,12(3):1245-1257.

[9]崔培梧，黎繼烈，肖作為.環(huán)氧基樹脂固定化青霉菌柚苷酶的工藝條件[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（5）：87-92.

[10]WEI Z H,DUAN Y Y,QIAN Y Q,et al.Screening ofGanodermastrains with high polysaccharides and ganoderic acid contents and optimization of the fermentation medium by statistical methods[J].Bioproc Biosyst Eng,2014,37(7):1789-1797.

[11]FAZENDA M,HARVEY L M,MCNEIL B.Effects of dissolved oxygen on fungal morphology and process rheology during fed-batch processing ofGanoderma lucidum[J].J Microbiol Biotechn,2010,20(4):844-851.

[12]陳祖滿.桑椹酒人工發(fā)酵過程中化學(xué)成分變化的研究[J].中國(guó)釀造，2010，29（8）：139-141.

[13]高 敏，曾新安，彭 酈，等.溫度對(duì)荔枝酒發(fā)酵的影響研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：96-98.

[14]王 玲，龐曉智.二氧化硫?qū)Σぬ}酒發(fā)酵過程及品質(zhì)的影響[J].食品工業(yè)，2010（4）：38-40.

[15]徐安書，郭 健，汪海英.楊梅果酒發(fā)酵工藝的研究[J].食品研究與開發(fā)，2015，36（3）：67-71.