高效液相色譜-熒光檢測(cè)法檢測(cè)大米中的赭曲霉毒素A

梁桂娟，張 瓊，楊 波

（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州 貴陽(yáng) 550004）

我國(guó)大多數(shù)人以大米為主食，但由于近些年來優(yōu)質(zhì)米的產(chǎn)量和銷量受到影響，導(dǎo)致一些糧食經(jīng)營(yíng)企業(yè)收購(gòu)的大米大量囤積。糧食在收獲時(shí)未被充分干燥或貯藏運(yùn)輸過程中濕度和溫度高都會(huì)加速糧食上的真菌迅速生長(zhǎng)[1-2]。真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長(zhǎng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對(duì)人類和動(dòng)物具有危害。赭曲霉毒素是由曲霉屬和青霉屬產(chǎn)生的一組重要的、污染食品的真菌毒素，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）的毒性最強(qiáng)[3]，它能對(duì)肝、免疫系統(tǒng)、腎等產(chǎn)生損害[4]，甚至有致畸和突變作用[5]，被世界衛(wèi)生組織的國(guó)際癌癥研究組織列為2B級(jí)疑致癌物質(zhì)[6]。GB 2761—2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》中規(guī)定谷物及其制品中赭曲霉毒素A的限量為5.0 μg/kg[7]。

目前報(bào)道的用于檢測(cè)赭曲霉毒素A的方法很多，主要有薄層層析法[8]，酶聯(lián)免疫吸附法[9]，膠體金免疫層析分析法[10]，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-12]，高效液相色譜-熒光檢測(cè)法[13]等。薄層層析法為定性或半定量的方法，檢測(cè)周期長(zhǎng)，靈敏度和重現(xiàn)性差。酶聯(lián)免疫法較為常用，且靈敏度高、簡(jiǎn)單快速，但檢測(cè)時(shí)假陽(yáng)性率較高。膠體金免疫層析技術(shù)是一種快速測(cè)定的方法，但適合于保鮮時(shí)間短、檢測(cè)量大的產(chǎn)品。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法省時(shí)高效，但成本高。而高效液相色譜-熒光檢測(cè)技術(shù)靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，而且可以用于同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜-熒光檢測(cè)技術(shù)分析檢測(cè)大米中的赭曲霉毒素A，為糧食中赭曲霉毒素A的檢測(cè)和調(diào)查提供良好的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米：市售。赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：北京泰樂祺科技有限公司。

0.22 μm有機(jī)濾膜：上海澤孚實(shí)業(yè)有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；氯化鈉、碳酸氫鈉等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

磷酸鹽緩沖溶液：取8.0 g氯化鈉，1.2 g磷酸氫二鈉，0.2 g磷酸二氫鉀，0.2 g氯化鉀溶于990 mL水中，用濃鹽酸調(diào)pH至7.0，再用水稀釋至1 L。

淋洗緩沖溶液：取25 g氯化鈉，5 g碳酸氫鈉溶于水中，加入0.1 mL吐溫-20，用水稀釋至1 L。

1.2 儀器與設(shè)備

YP202N型電子天平（感量0.01 g）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；EE2101粉碎機(jī)：普潤(rùn)有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀（帶熒光檢測(cè)器）：安捷倫科技有限公司；Bag-Mixer 400SW均質(zhì)器：法國(guó)interscience有限公司；Mnltireax振蕩混勻器：德國(guó)Heielolph公司；Allegra X-22R冷凍離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；TurboVap氮吹儀：美國(guó)Biotage公司；PriboFast 赭曲霉毒素免疫親和柱（25T）：北京泰樂祺科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：乙腈-水（1%甲酸）=45∶55；流速∶1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)333 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm。

1.3.2 樣品前處理

提?。喝》鬯榈臉悠?5.0 g（精確至0.01 g），加2.5 g氯化鈉和50 mL提取液，劇烈振蕩提取10 min，靜置，過濾，取5 mL濾液轉(zhuǎn)入25 mL比色皿中，用磷酸鹽緩沖液定容至刻度，混勻并過濾。

凈化：將上述濾液全部倒入玻璃注射器中，下接赭曲霉素免疫親和柱，以不超過1 mL/min的流速過柱。待流干后依次用10 mL淋洗緩沖液和10 mL水淋洗免疫親和柱，棄去，再用5.0 mL甲醇以上述方式洗脫，收集洗脫液，于45 ℃氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相定容至1 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)分析測(cè)定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取適量（精確至小數(shù)點(diǎn)后四位）赭曲霉素A標(biāo)準(zhǔn)品，用少量甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的赭曲霉素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取適量赭曲霉素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為2 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)使用液。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，赭曲霉毒素A含量（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 赭曲霉毒素A含量計(jì)算

試樣中赭曲霉毒素A含量的計(jì)算公式如下[15]：

式中：X為試樣中赭曲霉毒素A的含量，μg/kg；c為試樣提取凈化液中赭曲霉毒素A的含量，μg/L；V為甲醇洗脫液體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g；d為樣品稀釋比。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液色譜圖的繪制

根據(jù)1.3的色譜操作條件，得到標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的OTA色譜圖見圖1。由圖1可知，所得OTA色譜峰形對(duì)稱，基線平穩(wěn)，且樣品中的OTA和雜質(zhì)的分離度好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品加標(biāo)(B)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of standard (A) and sample (B)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖2可知，線性回歸方程為y=0.05x+0.005，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 16，結(jié)果表明，在0～200 ng/mL范圍內(nèi)二者線性關(guān)系良好。

圖2 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ochratoxin A

將標(biāo)準(zhǔn)品使用溶液逐級(jí)稀釋，以信噪比S/N=3時(shí)的質(zhì)量濃度為能檢測(cè)的最低質(zhì)量濃度，根據(jù)本方法中樣品的取樣量和定容體積，測(cè)得赭曲霉毒素A的檢出限為0.8 μg/kg。

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取樣品25.00 g，分別按照添加量為1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，之后按1.3.2的前處理方法和1.3.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)水平平行測(cè)定3次，測(cè)定其回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表1。

表1 樣品回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery assay

由表1可知，檢測(cè)結(jié)果所得平均回收率為77.7%～81.1%，平均RSD為2.1%～3.1%，表示該方法準(zhǔn)確度高。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步考察整個(gè)過程的一致性，對(duì)10 μg/L的赭曲霉素A標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，根據(jù)峰面積計(jì)算精密度及RSD，結(jié)果見表2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision assay

由表2可知，檢測(cè)結(jié)果的平均RSD為0.71%，＜5%，表示該方法精密度良好。

2.5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精確吸取來自同一批原料的試樣，按上述測(cè)定方法平行測(cè)定6次，檢驗(yàn)方法的重現(xiàn)性，結(jié)果見表3。

表3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of reproducibility assay

由表3可知，RSD=2.0%，＜5%，表明該方法重現(xiàn)性好，方法穩(wěn)定。

2.6 樣品中赭曲霉毒素A含量的測(cè)定

抽檢市面上不同來源的大米共38份，按1.3.1和1.3.2的儀器條件和前處理方法進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5份樣品含有OTA，其余均為未檢出，檢出率為13.2%，測(cè)得其含量分別為1.23 μg/kg、1.58 μg/kg、4.15 μg/kg、2.05 μg/kg、2.13 μg/kg，均小于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限量值（5 μg/kg）。這可能是由于不同樣品大米的產(chǎn)地、儲(chǔ)藏時(shí)間、儲(chǔ)藏環(huán)境都有所不同所導(dǎo)致。

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜-熒光光度法檢測(cè)大米中的赭曲霉毒素A含量的方法。結(jié)果表明，本方法前處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和精密度高，檢出限低，加標(biāo)回收率＞70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%，滿足食品檢測(cè)的相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)要求，能滿足對(duì)樣品快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。

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