酶聯(lián)免疫法與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬肉中沙丁胺醇

何方洋，于信念，王 坤，王兆芹

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京 102206；3.金元證券股份有限公司，廣東 深圳 518048）

沙丁胺醇是一種β-受體興奮劑藥物，常用于支氣管哮喘以及哮喘性支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病的治療[1]。由于沙丁胺醇能夠減少動(dòng)物的脂肪沉積、提高其瘦肉率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，因此被不良養(yǎng)殖者非法使用。如果食物中殘留沙丁胺醇，那么可導(dǎo)致人體心悸、發(fā)燒、頭痛、惡心、戰(zhàn)栗等癥狀，對(duì)消費(fèi)者的身體造成傷害[2-3]，因此，各國(guó)政府都嚴(yán)禁沙丁胺醇用作飼料添加劑，我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》明確規(guī)定沙丁胺醇等β-受體興奮劑被禁止所有用途，禁用所有食品動(dòng)物[4]。

目前，對(duì)于沙丁胺醇的殘留檢測(cè)主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）法、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrum，LC-MS）聯(lián)用分析法[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[7-9]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（capillary zone electrophoresis，CZE）[10-12]、酶聯(lián)免疫測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assays，ELISA）法[13-15]、膠體金免疫層析方法（colloidal gold immunochromatographic assay，GICA）等檢測(cè)方法[16-18]，儀器檢測(cè)方法具有檢測(cè)精確度高的優(yōu)點(diǎn)，但其儀器化程度高，樣品處理較復(fù)雜、檢測(cè)費(fèi)用高，難以對(duì)樣品進(jìn)行大量測(cè)定，而酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求較低，操作簡(jiǎn)單、快速，無(wú)需大型儀器，特異性也較高，可同時(shí)檢測(cè)大量樣品，因此本研究采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法（ELISA）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem spectrometry，LC-MS/MS）法測(cè)定豬肉樣品中沙丁胺醇的殘留量，對(duì)比分析這兩種方法的檢測(cè)限、準(zhǔn)確度、精密度，由此評(píng)估酶聯(lián)免疫法檢測(cè)沙丁胺醇的準(zhǔn)確性，為快速檢測(cè)方法的推廣使用提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉：市購(gòu)。

沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma 公司；沙丁胺醇試劑盒（其中包括包被有沙丁胺醇偶聯(lián)抗原的96孔酶標(biāo)板、6種質(zhì)量濃度的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品和1瓶高質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)二抗?jié)饪s液、抗體工作液、濃縮洗滌液、樣本稀釋液、底物液A液和B液、終止液）：北京勤邦生物技術(shù)有限公司；三氯乙酸、乙酸銨、高氯酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲酸水溶液、氨水甲醇溶液、β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶均為分析純：北京百欣試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance2695/Quattro液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司；DSY-Ⅲ氮吹儀：北京金科精華苑科技有限公司；Anke TDL-40B 低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；90-2 磁力攪拌器：上海振榮科學(xué)儀器有限公司；微量移液器（單道20～200 μL、100～1 000 μL、多道250 μL）、MK3酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司；DHP-600 生化培養(yǎng)箱：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；2000SBL 電子天平：美國(guó)Setra公司；QL-901 漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；8010S 勻漿機(jī)：上海斯伯明儀器設(shè)備有限公司；KS-Ⅱ振蕩器：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；DKZ-2 電熱恒溫振蕩水槽：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理方法

（1）酶聯(lián)免疫法樣品前處理方法

向（2.0±0.05）g豬肉均質(zhì)樣品中加入3%三氯乙酸2 mL，渦動(dòng)5 min，4 000 r/min室溫（20～25 ℃/68～77 ℉）條件下離心5 min；取上清液500 μL，加入0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）500 μL，充分混勻（pH值應(yīng)在7～9），取50 μL用于酶聯(lián)免疫法分析。

（2）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法的樣品前處理方法

豬肉樣品按照國(guó)標(biāo)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告—18—2008《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（檢測(cè)限為0.25 μg/kg）中的操作方法進(jìn)行樣品前處理[19]。

1.3.2 酶聯(lián)免疫方法測(cè)定沙丁胺醇方法

取出微孔板，向微孔中加入50 μL 沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品/處理好的樣品，然后加入抗體工作液：酶標(biāo)二抗?jié)饪s液（10∶1，V/V）50 μL，混勻，避光環(huán)境25 ℃下反應(yīng)30 min；用洗滌工作液250 μL/孔洗滌微孔板，然后加入50 μL底物液A液，再加入50 μL底物液B液，混勻，避光環(huán)境25 ℃下反應(yīng)15 min。最后加入50 μL終止液，混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量每孔的吸光度值。

1.3.3 ELISA測(cè)定沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品沙丁胺醇含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率的計(jì)算公式如下：

式中：B為標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液的平均吸光度值；B0為空

白（濃度為0標(biāo)準(zhǔn)溶液）的吸光度值。

以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的百分吸光率（y，%）為縱坐標(biāo)，以沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x，μg/L）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品中沙丁胺醇實(shí)際殘留量。

1.3.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定條件

（1）液相色譜條件

表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件Table 1 The conditions of mobile phase and gradient elution program

（2）質(zhì)譜條件

質(zhì)譜測(cè)定條件見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜測(cè)定條件Table 2 The condition of mass spectrum

1.3.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品濃度的計(jì)算

取陰性豬肉添加一定質(zhì)量濃度的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法處理，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，得到峰面積。以沙丁胺醇特征離子質(zhì)量色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以陰性豬肉添加的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制LC-MS/MS標(biāo)準(zhǔn)曲線，并采用外標(biāo)法定量。將樣品的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從而讀出樣品所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度即為樣品中沙丁胺醇實(shí)際殘留量。

1.3.6 準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)

分別以回收率和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示準(zhǔn)確度和精密度。稱取陰性豬肉2.0 g置于50 mL聚丙烯離心管中，分別添加沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品至終質(zhì)量濃度為1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg。然后利用酶聯(lián)免疫法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定沙丁胺醇?xì)埩袅康幕厥章屎妥儺愊禂?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA測(cè)定沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟，分別測(cè)定沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0、0.1 μg/L、0.3 μg/L、0.9 μg/L、2.7 μg/L、8.1 μg/L的吸光度值，經(jīng)ELISA分析，利用RIDAWIN數(shù)據(jù)分析軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 沙丁胺醇ELISA測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of salbutamol determined by ELISA

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-2.224 8x-0.815 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 8，其中半抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）值為0.366 μg/L，表明二者線性良好。

2.2 LC-MS/MS測(cè)定沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 沙丁胺醇LC-MS/MS測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of salbutamol of LC-MS/MS determined by LC-MS/MS

分別取陰性豬肉樣品添加沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L，按上述方法處理，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=2 303.89x，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 37，表明二者線性良好。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

常用回收率評(píng)估方法準(zhǔn)確度，用變異系數(shù)評(píng)估方法精密度，酶聯(lián)免疫法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表3和表4。

表3 ELISA方法測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Determination results of accuracy and precision tests by ELISA

表4 LC-MS/MS法測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Determination results of accuracy and precision tests by LC-MS/MS

由 表3、表4 可 知，分 別 添 加1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品的豬肉樣品，酶聯(lián)免疫法的平均加標(biāo)回收率分別為83.7%、90.2%和90.9%；變異系數(shù)為5.4%～10.3%，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的平均加標(biāo)回收率分別為86.6%、88.6%和93.5%，變異系數(shù)為6.0%～8.3%。兩種方法加標(biāo)回收率在83.7%～93.5%，變異系數(shù)＜10.3%，由此得出酶聯(lián)免疫法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的準(zhǔn)確度及精密度均較好。

2.4 檢測(cè)限

2.4.1 酶聯(lián)免疫法

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到20個(gè)空白豬肉樣品的沙丁胺醇質(zhì)量濃度。利用公式：檢測(cè)限=X+3s（X為重復(fù)測(cè)定空白樣品的平均值，s為重復(fù)測(cè)定空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)差），得到該方法的檢測(cè)限為0.5 μg/kg。

2.4.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

最低檢測(cè)限按照信噪比3∶1 計(jì)算，得到該方法的檢測(cè)限為0.25 μg/kg。

2.5 ELISA法和LC-MS/MS法檢測(cè)實(shí)際樣品結(jié)果

利用ELISA法檢測(cè)70份豬肉樣品，2份疑似陽(yáng)性豬肉樣品（沙丁胺醇質(zhì)量濃度＞0.5 μg/kg）被篩選出，用LC-MS/MS法確證這2份疑似陽(yáng)性豬肉樣品均為陽(yáng)性，結(jié)果見(jiàn)表5，陽(yáng)性豬肉樣品中沙丁胺醇的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 陽(yáng)性豬肉樣品1(A)及樣品2(B)中沙丁胺醇的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of salbutamol in positive pork sample 1(A) and 2(B)

表5 酶聯(lián)免疫法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果比較Table 5 Determination results of ELISA and LC-MS/MS

由表5可知，酶聯(lián)免疫方法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定沙丁胺醇?xì)埩袅拷Y(jié)果基本一致，并且酶聯(lián)免疫方法的假陽(yáng)性率為0，因此，適用于豬肉產(chǎn)品中沙丁胺醇?xì)埩袅繖z測(cè)的快速篩選。

3 結(jié)論

目前，酶聯(lián)免疫法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是測(cè)定動(dòng)物組織中沙丁胺醇?xì)埩袅繒r(shí)的常用方法。兩者的區(qū)別在于：酶聯(lián)免疫法能夠?qū)?dòng)物源性食品中沙丁胺醇?xì)埩暨M(jìn)行快速大量篩選，檢測(cè)時(shí)間僅為1～2 h，主要作為一種快速篩選手段，在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和基層檢測(cè)中廣泛使用。但由于快速篩選方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)很少，因此給檢測(cè)結(jié)果判定帶來(lái)一定困難。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法更為準(zhǔn)確、靈敏，適合對(duì)快速檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行確證。

本研究利用酶聯(lián)免疫法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉樣品中沙丁胺醇藥物殘留量，結(jié)果表明，1.0～4.0 μg/kg添加豬肉樣品時(shí)酶聯(lián)免疫法回收率為83.7%～90.9%，變異系數(shù)為5.4%～10.3%，檢測(cè)限為0.5 μg/kg；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的平均回收率分別為86.6%～93.5%，變異系數(shù)為6.0%～8.3%，檢測(cè)限為0.25 μg/kg。酶聯(lián)免疫法適用于進(jìn)行豬肉樣品中沙丁胺醇的快速篩選，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法適用于陽(yáng)性樣品的確證和精確定量。

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