何方洋,于信念,王 坤,王兆芹
(1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司,北京 102206;2.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心,北京 102206;3.金元證券股份有限公司,廣東 深圳 518048)
沙丁胺醇是一種β-受體興奮劑藥物,常用于支氣管哮喘以及哮喘性支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病的治療[1]。由于沙丁胺醇能夠減少動(dòng)物的脂肪沉積、提高其瘦肉率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng),因此被不良養(yǎng)殖者非法使用。如果食物中殘留沙丁胺醇,那么可導(dǎo)致人體心悸、發(fā)燒、頭痛、惡心、戰(zhàn)栗等癥狀,對(duì)消費(fèi)者的身體造成傷害[2-3],因此,各國(guó)政府都嚴(yán)禁沙丁胺醇用作飼料添加劑,我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》明確規(guī)定沙丁胺醇等β-受體興奮劑被禁止所有用途,禁用所有食品動(dòng)物[4]。
目前,對(duì)于沙丁胺醇的殘留檢測(cè)主要有高效液相色譜(high performance liquid chromatograph,HPLC)法、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrum,LC-MS)聯(lián)用分析法[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法[7-9]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(capillary zone electrophoresis,CZE)[10-12]、酶聯(lián)免疫測(cè)定(enzymelinked immunosorbent assays,ELISA)法[13-15]、膠體金免疫層析方法(colloidal gold immunochromatographic assay,GICA)等檢測(cè)方法[16-18],儀器檢測(cè)方法具有檢測(cè)精確度高的優(yōu)點(diǎn),但其儀器化程度高,樣品處理較復(fù)雜、檢測(cè)費(fèi)用高,難以對(duì)樣品進(jìn)行大量測(cè)定,而酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求較低,操作簡(jiǎn)單、快速,無(wú)需大型儀器,特異性也較高,可同時(shí)檢測(cè)大量樣品,因此本研究采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法(ELISA)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem spectrometry,LC-MS/MS)法測(cè)定豬肉樣品中沙丁胺醇的殘留量,對(duì)比分析這兩種方法的檢測(cè)限、準(zhǔn)確度、精密度,由此評(píng)估酶聯(lián)免疫法檢測(cè)沙丁胺醇的準(zhǔn)確性,為快速檢測(cè)方法的推廣使用提供基礎(chǔ)研究。
豬肉:市購(gòu)。
沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品:美國(guó)Sigma 公司;沙丁胺醇試劑盒(其中包括包被有沙丁胺醇偶聯(lián)抗原的96孔酶標(biāo)板、6種質(zhì)量濃度的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品和1瓶高質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)二抗?jié)饪s液、抗體工作液、濃縮洗滌液、樣本稀釋液、底物液A液和B液、終止液):北京勤邦生物技術(shù)有限公司;三氯乙酸、乙酸銨、高氯酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲酸水溶液、氨水甲醇溶液、β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶均為分析純:北京百欣試劑公司。
Alliance2695/Quattro液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國(guó)Waters公司;DSY-Ⅲ氮吹儀:北京金科精華苑科技有限公司;Anke TDL-40B 低速離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器有限公司;90-2 磁力攪拌器:上海振榮科學(xué)儀器有限公司;微量移液器(單道20~200 μL、100~1 000 μL、多道250 μL)、MK3酶標(biāo)儀:美國(guó)Thermo公司;DHP-600 生化培養(yǎng)箱:天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;2000SBL 電子天平:美國(guó)Setra公司;QL-901 漩渦混合器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司;8010S 勻漿機(jī):上海斯伯明儀器設(shè)備有限公司;KS-Ⅱ振蕩器:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;DKZ-2 電熱恒溫振蕩水槽:杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司。
1.3.1 樣品前處理方法
(1)酶聯(lián)免疫法樣品前處理方法
向(2.0±0.05)g豬肉均質(zhì)樣品中加入3%三氯乙酸2 mL,渦動(dòng)5 min,4 000 r/min室溫(20~25 ℃/68~77 ℉)條件下離心5 min;取上清液500 μL,加入0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)500 μL,充分混勻(pH值應(yīng)在7~9),取50 μL用于酶聯(lián)免疫法分析。
(2)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法的樣品前處理方法
豬肉樣品按照國(guó)標(biāo)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告—18—2008《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(檢測(cè)限為0.25 μg/kg)中的操作方法進(jìn)行樣品前處理[19]。
1.3.2 酶聯(lián)免疫方法測(cè)定沙丁胺醇方法
取出微孔板,向微孔中加入50 μL 沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品/處理好的樣品,然后加入抗體工作液:酶標(biāo)二抗?jié)饪s液(10∶1,V/V)50 μL,混勻,避光環(huán)境25 ℃下反應(yīng)30 min;用洗滌工作液250 μL/孔洗滌微孔板,然后加入50 μL底物液A液,再加入50 μL底物液B液,混勻,避光環(huán)境25 ℃下反應(yīng)15 min。最后加入50 μL終止液,混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量每孔的吸光度值。
1.3.3 ELISA測(cè)定沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品沙丁胺醇含量的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率的計(jì)算公式如下:
式中:B為標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液的平均吸光度值;B0為空
白(濃度為0標(biāo)準(zhǔn)溶液)的吸光度值。
以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的百分吸光率(y,%)為縱坐標(biāo),以沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(x,μg/L)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將樣品的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品中沙丁胺醇實(shí)際殘留量。
1.3.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定條件
(1)液相色譜條件
表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件Table 1 The conditions of mobile phase and gradient elution program
(2)質(zhì)譜條件
質(zhì)譜測(cè)定條件見(jiàn)表2。
表2 質(zhì)譜測(cè)定條件Table 2 The condition of mass spectrum
1.3.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品濃度的計(jì)算
取陰性豬肉添加一定質(zhì)量濃度的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述方法處理,經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析,得到峰面積。以沙丁胺醇特征離子質(zhì)量色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo),以陰性豬肉添加的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),繪制LC-MS/MS標(biāo)準(zhǔn)曲線,并采用外標(biāo)法定量。將樣品的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從而讀出樣品所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度即為樣品中沙丁胺醇實(shí)際殘留量。
1.3.6 準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)
分別以回收率和變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)表示準(zhǔn)確度和精密度。稱取陰性豬肉2.0 g置于50 mL聚丙烯離心管中,分別添加沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品至終質(zhì)量濃度為1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg。然后利用酶聯(lián)免疫法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定沙丁胺醇?xì)埩袅康幕厥章屎妥儺愊禂?shù)。
按照沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟,分別測(cè)定沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0、0.1 μg/L、0.3 μg/L、0.9 μg/L、2.7 μg/L、8.1 μg/L的吸光度值,經(jīng)ELISA分析,利用RIDAWIN數(shù)據(jù)分析軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 沙丁胺醇ELISA測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of salbutamol determined by ELISA
由圖1可知,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-2.224 8x-0.815 2,相關(guān)系數(shù)R2=0.992 8,其中半抑制濃度(50%inhibitory concentration,IC50)值為0.366 μg/L,表明二者線性良好。
圖2 沙丁胺醇LC-MS/MS測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of salbutamol of LC-MS/MS determined by LC-MS/MS
分別取陰性豬肉樣品添加沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L,按上述方法處理,經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。
由圖2可知,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=2 303.89x,相關(guān)系數(shù)R2=0.997 37,表明二者線性良好。
常用回收率評(píng)估方法準(zhǔn)確度,用變異系數(shù)評(píng)估方法精密度,酶聯(lián)免疫法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表3和表4。
表3 ELISA方法測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Determination results of accuracy and precision tests by ELISA
表4 LC-MS/MS法測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Determination results of accuracy and precision tests by LC-MS/MS
由 表3、表4 可 知,分 別 添 加1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品的豬肉樣品,酶聯(lián)免疫法的平均加標(biāo)回收率分別為83.7%、90.2%和90.9%;變異系數(shù)為5.4%~10.3%,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的平均加標(biāo)回收率分別為86.6%、88.6%和93.5%,變異系數(shù)為6.0%~8.3%。兩種方法加標(biāo)回收率在83.7%~93.5%,變異系數(shù)<10.3%,由此得出酶聯(lián)免疫法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的準(zhǔn)確度及精密度均較好。
2.4.1 酶聯(lián)免疫法
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到20個(gè)空白豬肉樣品的沙丁胺醇質(zhì)量濃度。利用公式:檢測(cè)限=X+3s(X為重復(fù)測(cè)定空白樣品的平均值,s為重復(fù)測(cè)定空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)差),得到該方法的檢測(cè)限為0.5 μg/kg。
2.4.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
最低檢測(cè)限按照信噪比3∶1 計(jì)算,得到該方法的檢測(cè)限為0.25 μg/kg。
利用ELISA法檢測(cè)70份豬肉樣品,2份疑似陽(yáng)性豬肉樣品(沙丁胺醇質(zhì)量濃度>0.5 μg/kg)被篩選出,用LC-MS/MS法確證這2份疑似陽(yáng)性豬肉樣品均為陽(yáng)性,結(jié)果見(jiàn)表5,陽(yáng)性豬肉樣品中沙丁胺醇的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)色譜圖見(jiàn)圖3。
圖3 陽(yáng)性豬肉樣品1(A)及樣品2(B)中沙丁胺醇的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of salbutamol in positive pork sample 1(A) and 2(B)
表5 酶聯(lián)免疫法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果比較Table 5 Determination results of ELISA and LC-MS/MS
由表5可知,酶聯(lián)免疫方法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定沙丁胺醇?xì)埩袅拷Y(jié)果基本一致,并且酶聯(lián)免疫方法的假陽(yáng)性率為0,因此,適用于豬肉產(chǎn)品中沙丁胺醇?xì)埩袅繖z測(cè)的快速篩選。
目前,酶聯(lián)免疫法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是測(cè)定動(dòng)物組織中沙丁胺醇?xì)埩袅繒r(shí)的常用方法。兩者的區(qū)別在于:酶聯(lián)免疫法能夠?qū)?dòng)物源性食品中沙丁胺醇?xì)埩暨M(jìn)行快速大量篩選,檢測(cè)時(shí)間僅為1~2 h,主要作為一種快速篩選手段,在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和基層檢測(cè)中廣泛使用。但由于快速篩選方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)很少,因此給檢測(cè)結(jié)果判定帶來(lái)一定困難。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法更為準(zhǔn)確、靈敏,適合對(duì)快速檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行確證。
本研究利用酶聯(lián)免疫法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉樣品中沙丁胺醇藥物殘留量,結(jié)果表明,1.0~4.0 μg/kg添加豬肉樣品時(shí)酶聯(lián)免疫法回收率為83.7%~90.9%,變異系數(shù)為5.4%~10.3%,檢測(cè)限為0.5 μg/kg;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的平均回收率分別為86.6%~93.5%,變異系數(shù)為6.0%~8.3%,檢測(cè)限為0.25 μg/kg。酶聯(lián)免疫法適用于進(jìn)行豬肉樣品中沙丁胺醇的快速篩選,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法適用于陽(yáng)性樣品的確證和精確定量。
[1]陳新謙,金有豫.新編藥物學(xué)(14 版)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1999.
[2]劉宣兵,龐玉芳,侯玉澤,等.沙丁胺醇的毒副作用及其殘留檢測(cè)[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2008,53(4):83-85.
[3]栗 艷.“瘦肉精”的危害及防治[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘,2011,27(4):175.
[4]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局.食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單[EB/OL].http://www.moa.gov.cn/sjzz/syj/dongtai/201006/t20100606_1535262.htm,2002-04-09.
[5]DAVID C J,KENARL D,GEORGE D,et al.The analysis of β-agonists by packed-column supercrltical fluid chromatography with ultraviolet and atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometric detection[J].Analysis,1999,124:827-831.
[6]梁曉聰,程國(guó)霞,朱參勝.GC/MS 法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物組織中4 種β-興奮劑殘留量[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(2):199-210.
[7]孟 娟,邵 兵,吳國(guó)華,等.氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物性食品中8 種β-興奮劑的殘留量[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15(6):641-643.
[8]SPISSO B F,LOPES C C,MARQUES M A,et al.Determination of β2-agonists in bovine urine comparison of two extraction/clean-up procedures for high-resolution gas chromatography-mass spectrometry analysis[J].J Anal Toxicol,2000,24(2):146-152.
[9]朱 堅(jiān),李 波,方曉明,等.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定肝、腎和肉中11種β2-受體激動(dòng)劑殘留量[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2005,26(3):129-137.
[10]陳紅青.高效毛細(xì)管電泳法用于飼料中鹽酸克侖特羅與沙丁胺醇含量的測(cè)定[J].福州大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2003,31(5):615-617.
[11]段建平,陳紅青,陳 穎,等.毛細(xì)管區(qū)帶電泳法同時(shí)測(cè)定飼料中西馬特羅、鹽酸克侖特羅和沙丁胺醇[J].色譜,2005,23(3):261-263.
[12]顏流水,溫振東,井 晶,等.豬肝中克倫特羅和沙丁胺醇的毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用分析[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2006,25(6):43-45.
[13]HOWELLS L,SAUER M,SAYER R,et al.Extraction and clean up of the beta agonist salbutamol from liver and its determination by enzyme immunoassay[J].Anal Chim Acta,1993,275(1-2):275-278.
[14]楊正濤,張乃生,史利軍,等.β-激動(dòng)劑多組分殘留的沒(méi)臉免疫分析法[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2008,24(8):23-24.
[15]王建平,沈建忠.豬肝和豬尿中沙丁胺醇和克倫特羅殘留的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2005,36(4):397-401.
[16]吳巧麗,葉春生.膠體金免疫層析技術(shù)快速檢測(cè)沙丁胺醇?xì)埩鬧J].現(xiàn)代食品科技,2012,28(11):1595-1599.
[17]張亞峰,張會(huì)彩,劉聚祥,等.沙丁胺醇膠體金免疫試紙條的研制[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2009,45(9):59-60.
[18]王 森,周亞蓮,盛慧萍,等.瘦肉精三合一膠體金快速檢測(cè)板的研制及在畜肉中的應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(12):1715-1719.
[19]中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.農(nóng)業(yè)部1025 號(hào)公告—18—2008,動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.