蔡騰龍,占劍峰,2*
(1.黃岡師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,湖北 黃岡 438000;2.黃岡師范學(xué)院 大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 黃岡 438000)
米糠是稻谷加工的副產(chǎn)品,其質(zhì)量占稻谷粒質(zhì)量的5.0%~5.5%。我國(guó)擁有豐富的米糠資源,米糠的年產(chǎn)量超過1 000萬t,是一種量大面廣的可再生資源[1]。而在米糠中,蛋白質(zhì)的含量可達(dá)到18%。米糠蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且是已知的過敏性較低的蛋白質(zhì)之一,它的必需氨基酸的種類齊全,特別是賴氨酸含量更接近聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(food and agriculture organization/world health organization,F(xiàn)AO/WHO)推薦模式[2-3],補(bǔ)償了谷物蛋白中賴氨酸不足的缺陷,大大提高了米糠蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,使其成為可以與動(dòng)物蛋白相媲美的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)[4-5]。在食品中,米糠蛋白可以應(yīng)用于功能性食品、嬰兒配方食品[6,11]、食品添加劑[7]、可食性膜[8-10]、生產(chǎn)替代谷氨酸鈉風(fēng)味肽、蛋白飲料保健食品、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、功能性多肽等。因此,優(yōu)化米糠蛋白的提取工藝,具有重要現(xiàn)實(shí)意義[11]。
由于米糠中蛋白質(zhì)的溶解性較差,在提取和分離純化時(shí)難度較大,造成提取率及純度皆不高。提取米糠蛋白的主要方法有堿法、物理法和酶法[12]。堿法提取米糠蛋白時(shí),強(qiáng)堿會(huì)引起蛋白中賴氨酸的損失,還會(huì)產(chǎn)生一些有害的副產(chǎn)物如賴氨酰丙氨酸,這會(huì)損害其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[13]。另外,堿液造成蛋白質(zhì)變性和水解;增加美拉德反應(yīng)的程度使蛋白質(zhì)的顏色變黑[14-15],造成蛋白質(zhì)商用品質(zhì)降低。而物理方法提取蛋白質(zhì)提取率比較低[16]。酶法提取米糠中的蛋白質(zhì)具有提取時(shí)間短、反應(yīng)條件溫和、不易產(chǎn)生有害物質(zhì)和能更多保留蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等優(yōu)點(diǎn)。本研究以蛋白提取率為依據(jù),采用響應(yīng)面分析法對(duì)酶法提取米糠蛋白工藝進(jìn)行研究,考察酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值和液料比對(duì)米糠蛋白提取率的影響,旨在為酶法提取米糠蛋白的最佳工藝確定提供參考。
米糠:市售;纖維素酶(10 000 U/g)、復(fù)合蛋白酶(100 000 U/g):天津眾信生物科技有限公司;磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙醇、磷酸、濃硫酸、鹽酸、無水硫酸銅、硫酸鉀、硼酸均為分析純:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
PB2002-10型電子天平:上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋、GZX-9240 MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;722s型可見分光光度計(jì):上海棱光技術(shù)有限公司;SC-2546型低速離心機(jī):安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;Kjeltec8400型凱氏定氮儀:丹麥FOSS;KL-009ATC型pH計(jì):上海比郎儀器有限公司。
1.3.1 提取工藝流程
米糠→pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液緩沖液中溶解→添加纖維素酶和復(fù)合蛋白酶(添加量各為2%)→保溫(50 ℃,2.5 h)→滅酶(100 ℃10 min)→4 000 r/min離心15 min →取上清液→測(cè)定→干燥→米糠蛋白
1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定
凱氏定氮法測(cè)米糠粗蛋白參考GB/T 5511—2008《谷物和豆類 氮含量測(cè)定和粗蛋白含量計(jì)算 凱氏法》[17]。
1.3.3 提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)
(1)液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響
提取時(shí)間2.5 h,提取溫度50 ℃,pH值為5.0時(shí),考察不同液料比(mL∶g)(8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。
(2)pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響
提取時(shí)間2.5 h,提取溫度50 ℃,液料比10∶1(mL∶g)時(shí),考察不同pH值(4.6、4.8、5.0、5.2、5.4)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。
(3)提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響
在液料比10∶1(mL∶g),提取溫度50 ℃,pH值為5.0時(shí),考察不同提取時(shí)間(1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。
(4)提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響
在提取時(shí)間2.5 h,液料比10∶1(mL∶g),pH值為5.0時(shí),考察不同提取溫度(40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。
1.3.4 提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用Design Expert 軟件,采用中心組合試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案,以酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值和液料比為響應(yīng)因子,以米糠蛋白提取率為響應(yīng)值,進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見表1。
表1 蛋白提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis for protein extraction process optimization
2.1.1 液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響
圖1 液料比對(duì)米糠蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of rice bran protein
由圖1可知,隨著液料比的升高,米糠蛋白提取率有不同程度的增加,當(dāng)液料比增加至10∶1(mL∶g)后,蛋白提取率開始下降,由于液料比超過10∶1(mL∶g)后,米糠顆粒與液體的接觸達(dá)到了飽和狀態(tài),再增加液料比,也不會(huì)提高米糠蛋白的溶出,反而由于液料比過大,為后續(xù)離心、濃縮和過濾過程帶來困難,降低了米糠蛋白的提取率,因此確定液料比為10∶1(mL∶g)。
2.1.2 pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響
由圖2可知,當(dāng)pH值<5.0時(shí),米糠蛋白質(zhì)的提取率呈遞增趨勢(shì),這是因?yàn)閜H值對(duì)水分子的作用表現(xiàn)為吸引力,所以米糠蛋白能被不斷提取出來;當(dāng)pH值>5.0后,其對(duì)水分子的作用表現(xiàn)為排斥力,米糠蛋白會(huì)隨著排斥力的增加而逐漸脫離水分子,故其提取率呈下降趨勢(shì)。所以,最終確定pH值為5.0。
圖2 p H值對(duì)米糠蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of pH on extraction rate of rice bran protein
2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響
由圖3可知,酶解時(shí)間<2.5 h時(shí),米糠蛋白的提取率呈遞增趨勢(shì),這是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加,米糠蛋白能夠被不斷浸提出。當(dāng)酶解時(shí)間>2.5 h后,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),使得米糠與緩沖液呈黏稠狀,并蒸發(fā)一部分含有米糠蛋白的液體,同時(shí)也為后續(xù)離心造成困難,其提取率逐漸降低。因此,選擇酶解時(shí)間為2.5 h最為適宜。
圖3 酶解時(shí)間對(duì)米糠蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on extraction rate of rice bran protein
2.1.4 酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響
圖4 酶解溫度對(duì)米糠蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction rate of rice bran protein hydrolysis
由圖4可知,在50 ℃時(shí)蛋白提取率較高,但溫度>50 ℃時(shí)蛋白提取率明顯下降,這是由于溫度過高引起的部分纖維素酶失活,酶解效果減弱且當(dāng)溫度超過50 ℃時(shí),淀粉開始糊化,阻礙了米糠蛋白的提取,所以提取率開始下降。因此,選擇50 ℃的酶解溫度最為適宜。
以酶活力為響應(yīng)值Y,通過Design-Expert 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)曲面分析,結(jié)果見表2,方差分析見表3。
采用Design Expert統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)模型以及回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。由表3可知,4個(gè)因素對(duì)米糠蛋白的提取率的影響的重要性次序依次為:液料比>pH值>酶解時(shí)間>酶解溫度。通過軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到米糠蛋白提取率對(duì)A、B、C和D的二次多項(xiàng)回歸方程為:
表2 蛋白提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface analysis for protein extraction process optimization
表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology
根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,從表3可以看出,大米蛋白的提取率回歸模型的F值為31.96,P<0.01,達(dá)到極其顯著水平;而失擬項(xiàng)的F值為5.25,P值為0.062 2>0.05,影響不顯著,說明該模型擬合結(jié)果良好。一次項(xiàng)A、C,交互項(xiàng)AB、BC和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的影響都是極顯著的,一次項(xiàng)B、D和交互項(xiàng)CD對(duì)結(jié)果影響顯著,交互項(xiàng)AC、AD、BD影響不顯著。方程的決定系數(shù)R2=0.919 3,這表明用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí),其因變量和全體自變量之間的關(guān)系顯著。對(duì)交互作用顯著的因素進(jìn)行分析,得到響應(yīng)面及等高線圖見圖5。
圖5 酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值和液料比對(duì)米糠蛋白提取率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of reaction time,pH,temperature and liquid-solid ratio on rice bran protein extraction rate
采用響應(yīng)面分析可知,酶法提取米糠蛋白的最佳工藝條件為液料比10.23,pH值5.06,酶解溫度48.80 ℃,酶解時(shí)間2.40 h。在此條件下得到米糠蛋白質(zhì)的提取率為39.69%。
為了檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性,采用上述優(yōu)化的測(cè)定條件進(jìn)行酶法提取米糠蛋白的試驗(yàn),考慮到實(shí)際的操作情況,將測(cè)定的條件修正為液料比10∶1(mL∶g),pH值5.0,酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間2.5 h。在此條件下測(cè)試3次,得到米糠蛋白質(zhì)的平均提取率為39.54%,實(shí)際值與理論值的相近,可見該模型可以很好地反映各因素對(duì)米糠蛋白質(zhì)的提取率的影響,同時(shí)也證明了用該方法研究米糠蛋白質(zhì)的提取率的可行性。
通過酶法提取米糠中的蛋白質(zhì),在纖維素酶及復(fù)合蛋白酶添加量均為2%條件下,通過對(duì)液料比,pH值,酶解溫度,酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn),同時(shí)利用Design Expert軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法,得到酶法提取米糠蛋白的最佳工藝參數(shù)為:液料比10∶1(g∶mL),pH值5.0,酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間2.5 h。在此條件下得到米糠蛋白質(zhì)的提取率為39.54%。本試驗(yàn)工藝流程酶法提取米糠蛋白溫度低;反應(yīng)時(shí)間短;對(duì)米糠蛋白變性、水解、營(yíng)養(yǎng)的影響小;能更好地保存其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;此外,酶法提取米糠蛋白產(chǎn)生的廢液少,能降低工業(yè)化生產(chǎn)的成本,同具有較好的前景。
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