合浦珠母貝基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建與分析

油九菊 , 范嗣剛 黃桂菊 郝博飛 , 陳飛飛 , 喻達(dá)輝

(1.農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南海生物資源與開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心, 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所, 廣東 廣州 510300; 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

合浦珠母貝(Pinctada fucata), 又名馬氏珠母貝(Pinctada martensiiDunker), 隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、珍珠貝目(Pterioida)、珍珠貝科(Pteriidae)、珠母貝屬(Pinctada)[1], 主要分布在中國(guó)的廣東、廣西、海南和臺(tái)灣沿海[2], 是目前我國(guó)用于培育海水珍珠的主要貝種之一。合浦珠母貝所產(chǎn)珍珠即為歷史上聞名遐邇的南珠, 是名貴裝飾品, 在國(guó)際上久負(fù)盛名。同時(shí),合浦珠母貝肉鮮美可食, 貝殼可加工成珍珠粉, 入藥治病。因此, 合浦珠母貝具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

中國(guó)海水珍珠養(yǎng)殖基地主要集中在廣東、廣西、海南三省區(qū)沿海地帶, 并成為其經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱性產(chǎn)業(yè)之一, 為這些地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和國(guó)家的出口創(chuàng)匯作出了巨大貢獻(xiàn)[3]。然而, 由于在過去數(shù)十年的珍珠貝生產(chǎn)中, 大量使用近緣養(yǎng)殖貝作為父母本進(jìn)行貝苗的培育, 導(dǎo)致了馬氏珠母貝的種質(zhì)急劇退化,養(yǎng)殖性能下降, 養(yǎng)殖成活率低, 個(gè)體變小, 育珠質(zhì)量下降等的問題[3-4]。開展合浦珠母貝的良種選育工作,培育優(yōu)良的育珠貝品系, 是科研人員當(dāng)前的重要任務(wù)。

微衛(wèi)星(microsatellite)又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR), 是以1～6bp的短核苷酸為基本單位, 如(AC)n、(AT)n、(CAG)n、(AGCT)n等, 首尾相連組成的串聯(lián)重復(fù)序列[5]。微衛(wèi)星標(biāo)記具有數(shù)量多、分布廣、共顯性遺傳、多態(tài)性豐富、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn), 已被廣泛用于動(dòng)植物的種群鑒定、選擇育種、遺傳多樣性分析及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等方面[6-8]。

迄今, 有關(guān)合浦珠母貝微衛(wèi)星序列的報(bào)道并不多, 得到的微衛(wèi)星標(biāo)記也很有限[9-12]。本研究擬采用磁珠富集法構(gòu)建合浦珠母貝微衛(wèi)星文庫(kù), 分離和篩選合浦珠母貝微衛(wèi)星標(biāo)記, 為合浦珠母貝的遺傳選育、群體遺傳學(xué)研究和遺傳圖譜的構(gòu)建提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

用于基因組微衛(wèi)星文庫(kù)構(gòu)建的合浦珠母貝閉殼肌組織于2008年12月份采自海南三亞, 2011年3月份取合浦珠母貝三亞養(yǎng)殖群體閉殼肌組織, 用于多態(tài)性引物的篩選。樣品均于95%酒精保存。按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[13]中的方法提取基因組DNA。提取的基因組 DNA 樣品用 1%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色檢測(cè), 并測(cè)定 OD260和 OD280, 檢測(cè) DNA 的質(zhì)量和計(jì)算濃度, 配成50 ng/μL的DNA備用。

1.2 酶切獲得目的片段

用限制性內(nèi)切酶MseⅠ于 37℃烘箱酶切基因組DNA 4 h, 酶切體系 30 μL, 包括 3 μL10×NEB Buffer2, 0.3 μL 100×BSA, 1 μLMseⅠ(10U/μL), 4 μL 50ng/μL基因組DNA, 滅菌雙蒸水補(bǔ)足。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。

1.3 接頭連接與PCR擴(kuò)增

用單鏈寡核苷酸合成雙連接頭, 每種寡核苷酸的濃度為 100 μmol/L。MseⅠ接頭序列為 Olig A:5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′, Olig B: 5′-TACTCA GGACTCAT- 3′。95℃變性10 min, 經(jīng)4 h緩慢冷卻至 10℃, 最終形成雙鏈接頭。將酶切產(chǎn)物與雙鏈接頭于 16℃連接過夜, 連接體系如下: 10×T4 DNA ligase Buffer (ATP+) 3 μL, 100 μmol/L 接頭 3 μL, 上述酶切片段 20 μL, 400 U/μL 的 T4 DNA ligase 0.5 μL,滅菌雙蒸水補(bǔ)足 30 μL。連接產(chǎn)物用簡(jiǎn)并引物MseⅠ-N [5′-GAT GAG TCC TGA GTA A(N)-3′] (N 代表堿基A、G、C、T)進(jìn)行25 μL體系的PCR預(yù)擴(kuò)增,包括 10×PCR buffer 2.5 μL, 10 mmol/L dNTPs 0.5 μL, 10 mmol/LMseⅠ-N 1 μL, 1 U Taq 酶, 酶切連接產(chǎn)物2 μL, 滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。PCR程序?yàn)? 95℃變性30 s, 58℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 共20個(gè)循環(huán); 之后72℃延伸10 min, 4℃。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增效果并擴(kuò)大體系。去除多余的引物、dNTPs等, 將PCR產(chǎn)物濃縮至30 μL。

1.4 雜交并磁珠富集微衛(wèi)星序列

1.4.1 雜交

100 μL雜交體系包括0.8 μL SSR 探針A(100 μmol/L)[為生物素標(biāo)記的(AC)15寡核苷酸: 5′bio-(AC)153′],21 μL 20×SSC, 0.7 μL 10% SDS, PCR 回收產(chǎn)物 3 μL,滅菌雙蒸水補(bǔ)足?；靹蚝?5℃變性10 min, 迅速降至58℃, 溫育20 min, 然后取出自然冷卻到室溫。

1.4.2 雜交期間磁珠的準(zhǔn)備

取 300 μL 充分搖勻的 Streptavidin MagneSphere?鏈霉素親和素順磁顆粒(Promega)溶液于1.5 mL離心管中, 1 mL TEN100(10 mmol/L Tris-Cl,1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, pH 7.5)混勻清洗磁珠3～5 min, 于架上1 min, 棄上清, 重復(fù)2次, 40 μL TEN100懸浮磁珠。

1.4.3 親和捕捉

雜交混合液與磁珠懸浮液混合, 加入 300 μL TEN100混勻。室溫放置30 min得吸附混合液(其間輕柔混合磁珠)。將吸附混合液于磁架上靜置1 min,棄上清, 400 μL松弛性洗滌液TEN1000(10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA, 1000 mmol/L NaCl, pH 7.5)洗滌5 min, 重復(fù)2次。400 μL嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌液(0.2×SSC,0.1% SDS)洗滌5 min, 重復(fù)2次。洗滌后的磁珠懸浮于50 μL TE緩沖液中, 95℃變性5 min。磁架上迅速分離上清, 保存為洗脫液①。再向磁珠中加入12 μL NaOH(0.15 mol/L)混勻室溫置 20 min, 分離的上清中加入1.8 μL HCl(1 mol/L), TE緩沖液補(bǔ)足50 μL體積, 保存為洗脫液②。核酸共沉劑沉淀回收兩次的洗脫產(chǎn)物, 溶于20 μL滅菌雙蒸水中, 即得到富含微衛(wèi)星序列的單鏈短基因組DNA片段。以此片段為模板,MseI primer為引物, PCR體系及條件同1.3連接產(chǎn)物的擴(kuò)增, 獲得富含微衛(wèi)星DNA的雙鏈短基因組DNA片段, 檢測(cè)富集效果。富集效果好的樣品用DNA Gel Extraction Kit(AXYGEN)切膠回收純化PCR產(chǎn)物, 濃縮至20 μL。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)回收效果并定量。

1.5 連接T-載體、克隆

連接反應(yīng)采用TaKaRa的pMD18-T試劑盒, 連接體系為 10 μL: Ligation Solution I 5 μL, PMD18-T Vector 0.5 μL, DNA 1 μL, DNA 片段 3 μL, 滅菌雙蒸水補(bǔ)足。16℃連接 4 h。用E.coliCompetent CellsDH5?(TaKaRa)進(jìn)行轉(zhuǎn)化, 得到基因組微衛(wèi)星文庫(kù)。

1.6 文庫(kù)篩選、測(cè)序、序列特征分析與引物設(shè)計(jì)

挑選單克隆, 接種到含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中, 37℃振蕩培養(yǎng)2 h, 菌液用載體PMD18-T的通用引物 M13-47[5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG AC-3′]、M13-48[5′-AGCGGATAACAATTTCACACA GGA-3′]和 寡 核 苷 酸 序 列 SSRm[5′-CACACACAC ACACACACACACAD-3′]進(jìn)行PCR篩選鑒定陽(yáng)性克隆, 并送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

用 Chromas軟件分析測(cè)序結(jié)果, 去掉載體序列和接頭序列。用SSRHunter軟件進(jìn)行微衛(wèi)星DNA序列查找: 6或6個(gè)拷貝以上的2堿基重復(fù)序列, 4或4個(gè)拷貝以上的3堿基重復(fù)序列, 3或3個(gè)拷貝以上的4堿基重復(fù)序列, 2或2個(gè)拷貝以上的6堿基重復(fù)序列。獲得的微衛(wèi)星序列根據(jù)Weber[14]提出的測(cè)序標(biāo)準(zhǔn),對(duì)其核心序列進(jìn)行類型劃分。用Primer Premier 5.0軟件對(duì)所得的微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 合浦珠母貝微衛(wèi)星文庫(kù)的構(gòu)建

MseⅠ酶切片段主要集中在 200～1000 bp, 表明合浦珠母貝基因組DNA酶切結(jié)果理想, 經(jīng)過PCR擴(kuò)增、雜交、富集, 得到的洗脫液 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化結(jié)果見圖1, 利用此富集產(chǎn)物構(gòu)建合浦珠母貝基因組微衛(wèi)星文庫(kù)。

圖1 PCR產(chǎn)物純化結(jié)果Fig.1 The purified PCR products

2.2 克隆與測(cè)序結(jié)果

本研究共獲得微衛(wèi)星文庫(kù)約2100個(gè)菌落。產(chǎn)生兩條或兩條以上擴(kuò)增帶的插入片段可以推測(cè)為含有微衛(wèi)星序列的陽(yáng)性克隆。通過 PCR篩選, 得到候選克隆483個(gè)(圖2)。對(duì)其中135個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)有 122個(gè)克隆含有重復(fù)次數(shù)大于或等于3的微衛(wèi)星序列( 90.37%)。圖3為測(cè)序得到的合浦珠母貝基因組中一段微衛(wèi)星特征的(AC)n重復(fù)序列。

圖2 陽(yáng)性克隆篩選Fig.2 Screening of positive clones

圖3 合浦珠母貝基因組中微衛(wèi)星特征的(AC)n重復(fù)序列Fig.3 Typical (AC)n repeat sequence in Pinctada fucata genomic microsatellite

2.3 微衛(wèi)星序列分析

根據(jù) Weber[14]提出的測(cè)序標(biāo)準(zhǔn), 合浦珠母貝微衛(wèi)星序列中完美型70個(gè), 占82.36%; 非完美型6個(gè),占7.59%; 復(fù)合型8個(gè), 占9.41%。

合浦珠母貝微衛(wèi)星序列最大重復(fù)次數(shù)為 73次,平均重復(fù)次數(shù)為7.83次, 其中, 重復(fù)6～10次的最多,占 57.75%, 其次為重復(fù) 2～5次(11.26%), 11～15次(15.49%), 16～20 次(9.86%), 詳見圖4。

圖4 合浦珠母貝微衛(wèi)星核心序列重復(fù)次數(shù)分布頻率Fig.4 The distribution frequency of the microsatellite corerepetition sequence in Pinctada fucata

2.4 引物設(shè)計(jì)

利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0對(duì)所得的85個(gè)微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì), 除去一些側(cè)翼序列較短不能設(shè)計(jì)引物外, 共設(shè)計(jì) 64對(duì)引物(75.29%)。通過優(yōu)化 PCR 反應(yīng)條件(如退火溫度, Mg2+濃度),本實(shí)驗(yàn)最終獲得 11對(duì)能穩(wěn)定有效擴(kuò)增的合浦珠母貝微衛(wèi)星多態(tài)性引物, 見表1。圖5為合浦珠母貝三亞群體在位點(diǎn)PY008(產(chǎn)物片段長(zhǎng)度160 bp)的擴(kuò)增譜帶。

圖5 合浦珠母貝群體在PY008位點(diǎn)的擴(kuò)增譜帶Fig.5 PCR products amplified from Pinctada fucata population at locus PY008

表1 合浦珠母貝微衛(wèi)星分子標(biāo)記及其引物Tab.1 Microsatellite loci and their primers in Pinctada fucata

3 討論

由于通過經(jīng)典的小片段DNA克隆法構(gòu)建和篩選部分基因組文庫(kù)分離獲得的微衛(wèi)星序列比例很低[15],因此對(duì)于大多數(shù)研究而言, 尋找一種高效簡(jiǎn)單的分離方法就成了研究的目標(biāo)。磁珠富集法是一種快速、高效的分離微衛(wèi)星分子標(biāo)記的方法, 自提出后被迅速?gòu)V泛地應(yīng)用于動(dòng)植物的微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選[16-17]。該方法所需時(shí)間較短, 獲得的微衛(wèi)星重復(fù)序列的比例高[15]。姬長(zhǎng)虹等[18]使用磁珠富集法篩選銀鯽的微衛(wèi)星, 陽(yáng)性克隆為 95.3%, 李小寧等[9]用磁珠富集法篩選合浦珠母貝的微衛(wèi)星, 陽(yáng)性克隆為 88.5%, 柳明等[19]利用磁珠富集法進(jìn)行了大珠母貝微衛(wèi)星的篩選, 報(bào)道的為70.81%, 曲妮妮等[10]用FIASCO法篩選合浦珠母貝的微衛(wèi)星, 陽(yáng)性克隆為 83.2%, 匡剛橋等[20]FIASCO法篩選鱖魚微衛(wèi)星標(biāo)記, 陽(yáng)性克隆為60%。本研究采用磁珠富集法篩選合浦珠母貝的微衛(wèi)星序列, 在所測(cè)135個(gè)克隆中有122個(gè)含有微衛(wèi)星序列,陽(yáng)性克隆率高達(dá) 90.37%, 說明磁珠富集法在貝類中也是一種高效快速的微衛(wèi)星標(biāo)記分離方法, 可以應(yīng)用到其他雙殼貝類微衛(wèi)星的分離研究。

與其他水產(chǎn)動(dòng)物相比, 貝類多態(tài)位點(diǎn)的篩選效率相對(duì)較低, 需要設(shè)計(jì)大量的引物才能獲得為數(shù)不多的多態(tài)標(biāo)記[9-10,21-23]。本研究合成的 65對(duì)合浦珠母貝微衛(wèi)星引物中有20對(duì)可以有效擴(kuò)增, 僅11對(duì)具有多態(tài)性, 多態(tài)性微衛(wèi)星比例僅有 16.92%。曲妮妮等[10]在篩選合浦珠母貝微衛(wèi)星標(biāo)記的研究中, 合成了49對(duì)引物只有9對(duì)具有多態(tài)性, 多態(tài)性微衛(wèi)星比例僅有18.36%。柳明等[19]對(duì)大珠母貝微衛(wèi)星的研究中, 合成的30對(duì)引物中僅有10對(duì)擴(kuò)增出具有多態(tài)性的目的條帶, 多態(tài)性微衛(wèi)星比例僅有 33.33%。所得到有多態(tài)性微衛(wèi)星的比例都很低, 原因可能與貝類個(gè)體之間的遺傳變異程度較大有關(guān)[10,19]。Arias等[24]對(duì)扇貝的SNPs檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)大約100個(gè)堿基就出現(xiàn)1次 SNP。Sauvage等[25]對(duì)太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)的研究, 發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)平均每60 bp出現(xiàn)1次SNPs, 在非編碼區(qū)每40 bp就出現(xiàn)1次SNPs。這些高頻率的點(diǎn)突變?yōu)槲⑿l(wèi)星引物的擴(kuò)增篩選帶來了很大困難。

研究表明, 微衛(wèi)星廣泛散在于真核生物基因組中, 特別是二核苷酸微衛(wèi)星重復(fù)(AC/TG)n(n大約為10～60)[26]在基因組中的含量十分豐富。本研究采用(AC)n探針, 獲得了85個(gè)微衛(wèi)星序列, 其中(AC/GT)n微衛(wèi)星引物有64對(duì), 占75.29%。除了大量的雙堿基序列(AC、AT、AG)外, 還有其它單堿基(A、C)、三堿基(ACA、ACG、AGG、AAC)、四堿基(AAAC、CTCT)和四堿基以上(ATTTG、AAAAC、ATTGGG、CGTCCG)的微衛(wèi)星序列, 因此可以考慮采用其他類型的探針, 如(AG)12、(ACA)15、(GATA)8、(GATT)7[9]研究開發(fā)合浦珠母貝基因組微衛(wèi)星, 以便獲得更多的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)與多態(tài)性之間存在正相關(guān)。Valdes[27]認(rèn)為重復(fù)次數(shù)低于5的微衛(wèi)星幾乎檢測(cè)不出多態(tài)性。一般微衛(wèi)星的核心序列重復(fù)次數(shù)越高, 其等位基因數(shù)也就越多, 即多態(tài)性也就越高[28]。Ellegren[29]認(rèn)為真核生物中微衛(wèi)星重復(fù)堿基重復(fù)序列長(zhǎng)度大多在30次重復(fù)以下。本研究所得序列重復(fù)次數(shù)在5～20次的占95.74%, 因此理論上講, 本研究所得引物可用于合浦珠母貝遺傳多樣性分析。

另外, 與哲羅魚[12]、中國(guó)對(duì)蝦[30]、劍尾魚[31]、長(zhǎng)牡蠣[17]、鯉[15]相比, 合浦珠母貝微衛(wèi)星序列中完美型比例最高, 為 82.36%, 而合浦珠母貝微衛(wèi)星非完美型比例僅為 7.59%, 僅比中國(guó)對(duì)蝦的(7.00%)高(表2)。目前為止, 關(guān)于微衛(wèi)星優(yōu)勢(shì)類型的種間差異現(xiàn)象報(bào)道較少, 孫效文等認(rèn)為可能與生物的進(jìn)化及環(huán)境的變遷有關(guān)[12]。筆者分析, 可能原因是合浦珠母貝是長(zhǎng)期以足絲管附著生活的貝類, 生態(tài)環(huán)境相比遷徙或浮游生活的水生動(dòng)物較穩(wěn)定, 較少有基因組復(fù)制過程中的變異。而李琪等[17]報(bào)道的固著生活的長(zhǎng)牡蠣完美型所占比例并無明顯優(yōu)勢(shì), 與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論不同。

表2 不同類型的微衛(wèi)星在水產(chǎn)動(dòng)物中的分布Tab.2 Distribution of different types of microsatellites in aquatic animals

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