濕疹不同證候核因子-κB、熱休克蛋白70的表達(dá)

龍劍文，皮先明，涂亞庭

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，武漢 430061;2.華中科技大學(xué)協(xié)和醫(yī)院皮膚科，武漢 430000)

濕疹不同證候核因子-κB、熱休克蛋白70的表達(dá)

龍劍文1，皮先明1，涂亞庭2

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，武漢 430061;2.華中科技大學(xué)協(xié)和醫(yī)院皮膚科，武漢 430000)

目的:觀察濕疹不同證候核因子-κB、熱休克蛋白70表達(dá)，探討其與濕疹不同證候發(fā)生的關(guān)系。方法:收集濕疹患者30例，包括風(fēng)濕熱蘊(yùn)證18例，血虛風(fēng)燥證12例，另取健康人8名作為對照。熒光定量PCR檢測各組組織中NF-κB mRNA和HSP70 mRNA表達(dá)水平，Western blot法檢測皮損內(nèi)核因子-κB、熱休克蛋白70蛋白表達(dá)。結(jié)果:HSP70 mRNA和蛋白表達(dá)，風(fēng)濕熱蘊(yùn)證組高于血虛風(fēng)燥證組和健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;血虛風(fēng)燥證組表達(dá)與健康對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)，風(fēng)濕熱蘊(yùn)證組表達(dá)高于血虛風(fēng)燥證組和健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;血虛風(fēng)燥證組表達(dá)高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:HSP70和NF-κB的表達(dá)程度可能體現(xiàn)了“濕瘡”病理過程中機(jī)體正邪力量，為揭示中醫(yī)濕瘡“證候”的本質(zhì)提供了理論依據(jù)。

濕疹;證候;核因子-κB;熱休克蛋白70

濕疹是由多種內(nèi)外因素引起的一種過敏性炎癥性皮膚病，臨床分為急性、亞急性、慢性濕疹。中醫(yī)學(xué)將其稱為濕瘡，外因風(fēng)濕熱邪侵襲，內(nèi)因脾失健運(yùn)、濕熱內(nèi)生，日久耗傷陰血，血虛風(fēng)燥，肌膚失養(yǎng)?；罨腘F-κB可以通過調(diào)控炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，引起炎癥反應(yīng)。而熱休克蛋白70是在不良因素作用下所產(chǎn)生的一組具有高度保守性的應(yīng)激蛋白，其表達(dá)可以通過增加血流量、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)和增殖、抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基損傷等機(jī)制而達(dá)到促進(jìn)炎癥消退、保護(hù)細(xì)胞的作用。因此，這兩者似乎在炎癥過程中扮演著邪氣正氣的角色［1］。本文通過觀察濕疹風(fēng)濕熱蘊(yùn)型、血虛風(fēng)燥型患者皮損核因子-κB p65、熱休克蛋白70的表達(dá)，以期對濕疹不同證候的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 病例選擇

濕疹診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《臨床皮膚病學(xué)》［2］濕疹診斷標(biāo)準(zhǔn)，中醫(yī)證候分型符合《中醫(yī)外科學(xué)》［3］診斷標(biāo)準(zhǔn)。入組時(shí)至少2周內(nèi)未局部使用糖皮質(zhì)激素治療，1月內(nèi)未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及光療等，不伴其他基礎(chǔ)疾病及其他皮膚病。入組風(fēng)濕熱蘊(yùn)證18例，血虛風(fēng)燥證12例，患者因診斷需要行組織病理學(xué)檢查，取材方法為環(huán)鉆取材或手術(shù)切除法，取材深度為真皮中下層，組織病理學(xué)符合濕疹診斷。8例正常皮膚組織來自外科門診正常包皮環(huán)切手術(shù)患者。

1.2 材料

分光光度儀為芬蘭雷勃公司產(chǎn)品(MultiskanMS，Labsystems Oy，Helsinki，F(xiàn)inland);細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國熱電，3111型);全自動(dòng)熒光定量PCR儀為Roche公司生產(chǎn)的lightcycler，Trizol總RNA提取試劑(美國Invitrogen);QuantScript RT Kit(北京天根生化);SYBR green熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(北京天根生化);兔抗人HSP70單克隆抗體、兔抗人NF-κB P65單克隆抗體(Santa cruz)。

1.3 方法

1.3.1 皮損標(biāo)本 RNA提取、鑒定、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR檢測。將皮損加Trizol后冷凍勻漿，置Eppendorf管15～30℃孵育5 min，加氯仿蓋緊蓋子用力搖動(dòng)20 s，15～30℃孵育5 min，4℃12000 r/ min離心15 min，將上層水相轉(zhuǎn)入新的EP管中，加異丙醇孵育10 min。4℃12000 r/min離心10 min，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀1次，4℃7500 r/min離心5 min棄乙醇、干燥加焦碳酸二乙酯水溶解所得RNA，－80℃保存?zhèn)溆?。每個(gè)樣品取5 ul RNA置l%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠液染色20 min，置紫外分光光度計(jì)測定波長260 nm吸光度值，測定RNA濃度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求合成cDNA并檢索基因庫，應(yīng)用Promo 5.0軟件設(shè)計(jì)上、下游引物。核因子-κB/P65mRNA上游引物:5-CGCAT CCAGACCAACAACA-3，下游引物:5-TGCCAGAG TTTCGGTTCAC-3，擴(kuò)增片段長度217 bp。HSP70 mRNA上游引物:5-CACCACCTACTCCGACAACCA-3，下游引物:5-GCCCCTAATCTACCTCCTCAA-3。βactin上游引物:5-ATGGATGATGATATCGCCGCG-3，下游引物:5-TCTCCATGTCGTCCCAGTTG-3。取cDNA 1 μL，加2.5×RealMasterMix11.25 μL，上下游引物各1 μL，加無Rnase水至反應(yīng)總體積25 μL; PCR反應(yīng)條件:95℃變性2 min，PCR循環(huán)中95℃變性15 s，50℃退火30 s，68℃延伸50 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果計(jì)算采用△Ct值法:△Ct=樣品的Ct均值－內(nèi)參的Ct均值，-2△△Ct即某樣品初始cDNA的相對量。

1.3.2 Western-blot檢測皮損組織內(nèi)HSP70、NF-κB蛋白表達(dá) 向－20℃保存的組織加入組織細(xì)胞蛋白提取液，用組織勻漿器冷凍勻漿。取出放入EP管中，4℃1200 r/min離心20 min，取上清液放入另一EP管中重懸于200 ul預(yù)冷的緩沖液中，冰浴10 min使細(xì)胞腫脹。加入 NP-40至終濃度為0.5%，振蕩10 s，4℃ 10000 g離心1min，小心吸取上清，此為胞質(zhì)蛋白。沉淀物以預(yù)冷的緩沖液洗滌3次后，重懸于50 ul預(yù)冷的緩沖液中，冰浴30 min間斷振蕩，以抽提核蛋白;4℃12000 g離心20 min，小心吸取上清，內(nèi)含核蛋白，測定蛋白濃度后，分裝凍存于－70℃?zhèn)溆?。加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜后加入HSP70、NF-κB單克隆抗體(1∶400)，4℃過夜，再洗膜5 min 2次，換塑料袋，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1000)，37℃搖床孵育1 h，洗膜5 min 2次。加入化學(xué)發(fā)光底物孵育，暗室感光、膠片感光，凝膠成像分析儀掃描、軟件分析圖像并讀取灰度值，以β-actin作為內(nèi)參照。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組間均數(shù)比較用 t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組皮損NF-κB mRNA、HSP70 mRNA表達(dá)的比較

表1 各組皮損NF-κB mRNA、HSP70 mRNA表達(dá)比較(±s)

表1 各組皮損NF-κB mRNA、HSP70 mRNA表達(dá)比較(±s)

注:與血虛風(fēng)燥證組比較:◆P＜0.05;與健康對照組比較:▲P＜0.05;與血虛風(fēng)燥證組比較:■P＜0.05

項(xiàng)目 例數(shù) NF-κB mRNA HSP70 mRNA風(fēng) 濕 熱 蘊(yùn) 證 組 18 1.28±0.19◆ 1.34±0.21■8 1.00±0.02 1.00±0.01血 虛 風(fēng) 燥 證 組 12 1.12±0.19▲ 1.06±0.18健康對照組

表1顯示，風(fēng)濕熱蘊(yùn)證組NF-κB mRNA表達(dá)高于血虛風(fēng)燥證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);血虛風(fēng)燥證組表達(dá)高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。風(fēng)濕熱蘊(yùn)證組HSP70 mRNA表達(dá)高于血虛風(fēng)燥證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);血虛風(fēng)燥證組表達(dá)與健康對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 各組皮損NF-κB和HSP70蛋白表達(dá)比較

圖1、2顯示，風(fēng)濕熱蘊(yùn)證組核內(nèi)NF-κB蛋白高于血虛風(fēng)燥證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);血虛風(fēng)燥證組表達(dá)高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。風(fēng)濕熱蘊(yùn)證組HSP70蛋白高于血虛風(fēng)燥證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);血虛風(fēng)燥證組表達(dá)與健康對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 各組皮損NF-κB蛋白的表達(dá)

3 討論

濕疹是由多種內(nèi)外因素引起的淺層真皮和表皮炎癥，屬于中醫(yī)學(xué)濕瘡范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為濕瘡是由于稟賦不耐，風(fēng)、濕、熱阻于肌膚所致。濕熱蘊(yùn)久傷及陰血，血虛生風(fēng)生燥，肌膚失養(yǎng)。

圖2 各組皮損HSP70蛋白的表達(dá)

HSP70是熱應(yīng)激反應(yīng)的重要標(biāo)志物，可以被各種刺激誘導(dǎo)，對機(jī)體起內(nèi)源性保護(hù)作用，其保護(hù)作用主要通過分子伴侶作用、抗炎、抗凋亡及抗氧化作用來實(shí)現(xiàn)［4-5］。研究表明，HSP的抗炎作用可能與其能穩(wěn)定NF-κB/IκB復(fù)合體、阻止NF-KB的活化、從而減少炎性介質(zhì)產(chǎn)生有關(guān)［6］。HSP70家族是HSP中最保守和最主要的一類，類似中醫(yī)“正氣”的作用。NF-κB是一類能與多種基因啟動(dòng)子特異性結(jié)合并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)總稱，幾乎存在于所有的細(xì)胞中，廣泛參與多種基因特別是免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，影響炎癥反應(yīng)過程。NF-κB是P65/ P50組成的異源二聚體復(fù)合物，與抑制型IKB蛋白結(jié)合存在于細(xì)胞的胞漿中。在炎癥介質(zhì)、應(yīng)激反應(yīng)等因素刺激下，IKB發(fā)生磷酸化并降解，NF-κB活性增加，P65和P50的mRNA轉(zhuǎn)錄增加，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位與DNA上特定序列結(jié)合，其中P65含有轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域，可促進(jìn)多種炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［7］，類似中醫(yī)“邪氣”的作用。高英等［8］研究表明，HSP60、NF-κB p65在中、重度特應(yīng)性皮炎患者皮損角質(zhì)形成細(xì)胞中均過度表達(dá)，與本文研究結(jié)果類似。崔娜娟等［9］研究表明，慢性胃炎脾胃濕熱證患者胃黏膜核因子-κB mRNA、熱休克蛋白70 mRNA的表達(dá)均高于健康對照組，與本文濕疹風(fēng)濕熱蘊(yùn)證組結(jié)果類似，說明濕熱證患者局部損害可能存在核因子-κB/P65和HSP70的高表達(dá)。慢性胃炎脾氣虛證患者胃黏膜核因子-κB mRNA、熱休克蛋白70 mRNA的表達(dá)與健康對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而我們的研究表明，濕疹血虛風(fēng)燥證患者皮損核因子-κB/P65 mRNA和蛋白的表達(dá)高于健康對照組，而熱休克蛋白70 mRNA和蛋白的表達(dá)與健康對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示氣虛證和血虛證患者在局部細(xì)胞因子的表達(dá)上可能存在差異，尚需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，風(fēng)濕熱蘊(yùn)證組HSP70 mRNA及蛋白表達(dá)、NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)均高于血虛風(fēng)燥證組和健康對照組，反映出邪正相爭邪氣盛、正氣奮起抗邪的病理狀態(tài)。血虛風(fēng)燥證組 NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)高于健康對照組，HSP70 mRNA及蛋白表達(dá)低于風(fēng)濕熱蘊(yùn)證組，可能反映出邪盛正虛的病理狀態(tài)。綜上所述，HSP70、NF-κB的表達(dá)可能反映出中醫(yī)濕瘡正邪相爭的某些特點(diǎn)，為揭示中醫(yī)濕瘡“證候”的本質(zhì)提供了理論依據(jù)。

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Expression of NF-κB and Heat Shock Protein 70 in skin lesion of patients with eczema in different syndromes

LONG Jian-wen1，PI Xian-ming1，TU Ya-ting2
(1.Department of dermatology，Affiliated hospital of Hubei university of Chinese medicine，Hubei Wuhan 430061，China;2.Department of dermatology，Union hospital of Huazhong University of Science and Technology Hubei Wuhan 430000，China)

Objective:To investigate the expression of Heat Shock Protein 70(HSP70)and NF-κB p65 in skin lesion of patients with eczema in different syndromes and the roles of them in eczema of different syndromes.Methods:30 cases of patients with eczema were collected，18 cases were wind-damp-heat syndrome，12 cases were blood deficiency and wind dryness syndrome，meanwhile，8 of healthy people were as control.The mRNA expression of NF-κB and HSP70 in tissues were determined quantitatively with FQ-PCR.The protein expression of NF-κB and HSP70 in tissues were determined quantitatively with western blot.Results:The mRNA and protein expression of HSP70 in the wind-damp-heat syndrome group was higher significantly than that in the blood deficiency and wind dryness syndrome group and the control group.While there was no significantly different between the blood deficiency and wind dryness syndrome group and the control group.The mRNA and protein expression of NF-κB p65 in the wind-damp-heat syndrome group was higher significantly than that in the blood deficiency and wind dryness syndrome group and the control group;The mRNA and protein expression of NF-κB p65 in the blood deficiency and wind dryness syndrome group was higher significantly than that in and the control group.Conclusion:The expression level of NF-κB p65 and HSP70 may reflect the strengths of pathogens and vital Qi respectively.The result provided some clues to investigate the Chinese medicine“syndrome”nature of eczema.

Eczema;Syndrome;Heat Shock Protein 70;NF-κB

R752.1

B

1006-3250(2015)06-0694-03

2015-02-10