脾虛證大鼠模型胃組織cAMP-PKA信號傳導通路變化的研究*

宋 囡，賈連群，王俊巖，單德紅，何麗娟，曹 媛，朱美林，楊關林

(遼寧中醫(yī)藥大學省部共建中醫(yī)藏象理論及應用教育部重點實驗室，沈陽 110032)

脾虛證大鼠模型胃組織cAMP-PKA信號傳導通路變化的研究*

宋 囡，賈連群，王俊巖，單德紅，何麗娟，曹 媛，朱美林，楊關林△

(遼寧中醫(yī)藥大學省部共建中醫(yī)藏象理論及應用教育部重點實驗室，沈陽 110032)

目的:探討脾氣虛證和脾陽虛證大鼠胃組織的改變與cAMP-PKA信號通路的相關性。方法:將24只雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、脾氣虛組、脾陽虛組，脾氣虛采用飽食1 d、禁食2 d、游泳15 d，脾陽虛采用脾氣虛證加灌服番瀉葉造模，造模后檢測大鼠胃組織cAMP活性及PKA、CREB mRNA和蛋白的表達。結果:脾氣虛組和脾陽虛組胃組織cAMP活性及PKA、CREB mRNA和蛋白表達均減弱。結論:脾氣虛證和脾陽虛證大鼠胃組織的改變與cAMP-PKA信號傳導通路有一定的相關性。

脾氣虛證;脾陽虛證;環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A;信號傳導

目前，臨床多種慢性疾病的發(fā)病過程中，幾乎都能出現(xiàn)屬于中醫(yī)脾虛證的不同證型，且多以脾氣虛證和脾陽虛證為主?？梢姡角笃⑻撟C的現(xiàn)代病理生理學基礎，是提高中西醫(yī)結合辨證的重要途徑之一。環(huán)磷酸腺苷蛋白激酶 (Cyclicadenosine monophosphate-protein kinase A，cAMP-PKA)途徑是參與物質能量代謝的主要細胞傳導通路。已有研究表明，脾虛證與cAMP-PKA信號傳導通路具有一定的相關性?；诖?，本研究通過分析比較脾氣虛證和脾陽虛證大鼠胃組織cAMP-PKA信號通路變化，為中醫(yī)脾虛證的臨床診斷提供理論基礎和實驗依據(jù)，同時也為探討中醫(yī)證型研究與信號通路相關性提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 24只SPF級雄性SD大鼠，體質量(200±10)g，購于本溪實驗動物中心(許可證號SCXK(遼)-2010-0001)。

1.1.2 試劑 Real Time RT-PCR試劑盒(TaKaRa，code:DRR047A，DRR820A)，Anti-β-actin抗體(中杉金橋，中國)，Anti-PKA抗體、Anti-CREB抗體、Anti-p-CREB抗體(ABcam，美國)，PMSF (Genview分裝，美國)，BCA蛋白測定試劑盒(北京鼎國昌盛，中國)，凝膠制備試劑盒(武漢博士德，中國)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)(Genview分裝，美國)，甘氨酸(Glycin)(Genview分裝，美國)，十二烷基硫酸鈉(SDS)(Genview分裝，美國)，TBS緩沖液(武漢博士德，中國)。

1.1.3 儀器 低速冷凍離心機(Thermo，美國)，BioSpec-nano型紫外可見分光光度計(島津，日本)，Veriti96 wellThermalCycler(Applied Biosystems，美國)，7500 Real Time PCR儀(AppliedBiosystems，美國)，微型垂直電泳槽HE-180(上海天能，中國)，轉移電泳槽VE-1861(上海天能，中國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及造模 24只SPF級雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、脾氣虛證模型組、脾陽虛證模型組，每組8只。脾氣虛證模型的建立方法采用飲食不節(jié)加力竭游泳，即3 d為一循環(huán)，先飽食1 d再禁食2 d，自由飲水;每日游泳至力竭，水溫35～37℃，連續(xù)15 d。脾陽虛證造模方法采用脾氣虛證加灌服番瀉葉，即先建立脾氣虛模型，即3 d為一循環(huán)，先飽食1 d再禁食2 d，自由飲水;每日游泳至力竭，水溫35～37℃，連續(xù)15 d，當大鼠出現(xiàn)食少、神疲乏力、消瘦、毛色枯槁無光澤、便軟或溏等表現(xiàn)后，番瀉葉灌服早晚各1次，連續(xù)1周。

1.2.2 模型評價 擬定脾氣虛證評定標準:食少;神疲乏力;消瘦;毛色枯槁無光澤，便軟或溏。脾陽虛證模型評價標準:四肢不溫;便溏;不欲飲;食少，毛色枯槁無華。

1.2.3 ELISA法檢測胃組織cAMP含量 根據(jù)試劑盒說明書設立標準品孔、樣品孔和空白對照孔，標準品孔加入不同濃度的標準品50 μL。樣品孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL。標準品孔和樣本孔每孔加入辣根酶標記抗體100 μL，37℃水浴鍋溫育60 min，后洗板5次，吸水紙拍干。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。加入終止液50 μL，450 nm波長測定各孔的吸光度(A)值。計算機根據(jù)各標準品吸光度以及標準品濃度，計算檢測樣品濃度。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測胃組織PKA、環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)mRNA含量 表1顯示，取大鼠胃竇仔細剝離附著肌肉、結締組織，用RNAisoPlus試劑盒提取胃壁全層總RNA，吸光度測定方法檢測RNA濃度和純度。RNA純度A260/ A280應在1.8～2.2范圍內?；蚪MDNA去除體系:5 μL 200 ng/L total RNA，2.0 μL 5 ×gDNA Eraser Buffer，1.0 μL gD-NA Eraser，2.0 μL RNase Free dH2O，PCR儀反應條件:①42℃ 2 min;②4℃保存。RT反應體系:去除基因組DNA的總RNA，4 μL 5 × PrimeScript Buffer 2(for real time)，1 μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ，1 μL RT Primer Mix，RNase Free dH2O 4 μL，PCR儀反應條件:①37℃15 min;②85℃ 5 s;③4℃保存。PCR擴增反應體系:9.5 μL RNase FreedH2O，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，12.5 μLSYBR Premix Ex TaqⅡ，在每個0.2 mL 8聯(lián)PCR反應管中加入23 μL PCR擴增反應液，并在每個反應管中加入2 μL cDNA，PCR儀中real timePCR反應條件:①95℃ 2 min;②95℃ 30 s;60℃30 s，40個循環(huán)。根據(jù)NTC反應有無熒光信號檢出，并結合熔解曲線確認反應體系是否有污染;標準曲線的相關系數(shù)(R2)＞0.98;擴增效率(E)應在0.8～1.2范圍。采用雙δ法換算樣品中mRNA含量，再以β-Actin作為內參照計算樣品中mRNA相對表達量，引物委托TaKaRa公司設計合成。

1.2.5 Westernblot法檢測胃組織 PKA、p-CREB蛋白含量 取大鼠胃組織稱取100 mg放入玻璃勻漿器中，加入1 mL裂解液(蛋白裂解液與PMSF比例為100∶1)在冰上充分研磨;吸入到預冷1.5 mL無菌EP管中;12000 r/min，4℃離心10 min取上清;BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性后每孔上樣20 μL，電泳后轉膜3 h，一抗孵育1 h后，4℃ 過夜;次日二抗孵育1 h后，暗室中加入ECL發(fā)光液后曝光30 min，掃描圖像后分析結果，目的蛋白與內參 GAPDH條帶的光密度比值后各組再比較。

1.3 統(tǒng)計學方法

計量資料采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析、F檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 模型評價

2.1.1 大鼠生物學特征評估 正常組大鼠體格健壯、反應敏捷、行動迅速，被毛緊密有光澤、大便正常;脾氣虛組大鼠明顯消瘦、神疲乏力、反應遲鈍、行動緩慢、被毛蓬起無光澤、便軟，符合脾氣虛證動物模型評估標準。脾陽虛組大鼠出現(xiàn)弓背、扎堆、肛溫下降、便稀或肛周污穢、神疲乏力、反應遲鈍、消瘦、毛色枯槁無光澤，符合脾陽虛證動物模型評估標準。

2.1.2 各組大鼠體質量與肛溫的變化 表2顯示，在造模過程中，脾氣虛組脫落1只，脾陽虛組脫落2只，均因游泳后死亡。體質量變化為造模結束時與造模前的差值比較，肛溫變化為造模結束時模型組與正常組比較。實驗結果顯示，與正常組比較，脾氣虛證組大鼠和脾陽虛證組大鼠的體質量變化均有差異(P＜0.01);同時與正常組和脾氣虛證組比較，脾陽虛證組大鼠的肛溫有所下降(P＜0.01)。

2.2 各組大鼠胃組織cAMP含量比較

表3顯示，正常組和脾氣虛組各有1只大鼠取材時因麻醉過量取出血清過少被剔除。實驗結果顯示，與正常組比較，脾氣虛組大鼠和脾陽虛組大鼠的胃組織cAMP含量均減少(P＜0.01)，脾氣虛組與脾陽虛組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。

表2 造模結束各組大鼠體質量差值及肛溫比較(±s)

表2 造模結束各組大鼠體質量差值及肛溫比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與脾氣虛組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組 別 鼠數(shù) 體質量(g) 肛溫(℃) 8 30.63±7.27 37.26±0.33脾氣 虛 組 7 －7.57±3.64＊＊ 36.79±0.30脾陽 虛 組 6 －15.50±2.88＊＊▲ 35.87±0.74正常組＊＊▲▲

2.3 各組大鼠胃組織PKA mRNA和蛋白表達

圖1顯示，與正常組比較，脾氣虛組大鼠和脾陽虛組大鼠的胃組織PKA mRNA表達均減弱(P＜0.05)，脾氣虛組與脾陽虛組之間比較差異無統(tǒng)計學意義;同時與正常組比較，脾氣虛組大鼠和脾陽虛組大鼠胃組織PKA蛋白表達均減弱(P＜0.01)，且與脾氣虛組比較，脾陽虛組大鼠的胃組織PKA蛋白的表達也有所減弱(P＜0.01)。

表3 各組大鼠胃組織cAMP含量比較(±s)

表3 各組大鼠胃組織cAMP含量比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與脾氣虛組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組 別 鼠數(shù) cAMP含量(pmol/mg) 0.375±0.041脾氣虛組 6 0.285±0.034＊＊脾陽虛組 6 0.245±0.034正常組7＊＊

2.4 各組大鼠胃組織CREB mRNA和蛋白表達

圖2顯示，實驗結果顯示，與正常組比較脾氣虛組大鼠和脾陽虛組大鼠胃組織CREB mRNA表達均減弱(P＜0.01)，且與脾氣虛組比較，脾陽虛組大鼠胃組織 CREB mRNA的表達也有所減弱(P＜0.01);同時與正常組比較，脾氣虛組大鼠和脾陽虛組大鼠的胃組織 CREB蛋白表達均減弱(P＜0.01)，但與脾氣虛組比較，脾陽虛組大鼠的胃組織CREB蛋白表達有所增強(P＜0.01)。

圖1 脾氣虛證與脾陽虛證大鼠胃組織PKA mRNA和蛋白表達

3 討論

圖2 脾氣虛證與脾陽虛證大鼠胃組織CREB mRNA和蛋白表達

中醫(yī)認為，脾為后天之本，即人始生本于精血之源，而人既生則賴于水谷的榮養(yǎng)。正是由于脾在源源不斷地提供能量，五臟才能安和。所以我們可以認為，脾是人體能量的發(fā)動機。歷代醫(yī)家也認為，脾的最主要生理功能是脾主運化，為氣血生化之源、后天之本?！端貑枴れ`蘭秘典論》說:“脾胃者，倉廩之官，五味出焉?！薄毒霸廊珪髦忆洝げ叵髣e論》說:“血者水谷之精氣也，源源而來，而實生化于脾。”《醫(yī)宗必讀·腎為先天本脾為后天本論》說:“后天之本在脾，脾為中宮之土，土為萬物之母?！惫手嗅t(yī)認為，脾胃為人體氣血生化之源，人體的水谷代謝和氣血旺盛有賴于脾胃的健壯［1-2］。由此可見，脾胃的功能與能量代謝有密切關系，同時也可以解釋臨床多種慢性疾病的發(fā)病過程中，幾乎都能出現(xiàn)屬于中醫(yī)脾虛證的原因。現(xiàn)代醫(yī)學認為，組織器官及肌肉代謝相關酶的活性變化與線粒體的變化均是脾虛證發(fā)生的病理機制。因此，將中醫(yī)的脾虛證與現(xiàn)代醫(yī)學有機結合是迫切的。由于cAMP-PKA信號通路是參與物質能量代謝的主要細胞傳導通路，所以本文則以脾氣虛證和脾陽虛證大鼠胃組織為例，側重研究脾虛證與cAMP-PKA信號通路的相關性。

首先，本實驗將大鼠造模后進行模型評估，造模后脾氣虛組大鼠出現(xiàn)明顯消瘦、神疲乏力、反應遲鈍、行動緩慢、被毛蓬起無光澤、便軟等癥狀;而脾陽虛組大鼠則出現(xiàn)弓背、扎堆、肛溫下降、便稀或肛周污穢、神疲乏力、反應遲鈍、消瘦、毛色枯槁無光澤等癥狀。同時，我們觀察大鼠造模前后體質量變化及造模后肛溫變化，實驗結果均說明符合脾氣虛及脾陽虛證動物模型標準。

cAMP-PKA-CREB途徑是細胞信號傳導的主要途徑，cAMP是某些激素和遞質的第二信使，是激素和遞質信號作用于特定靶細胞后，通過激活腺苷酸環(huán)化酶由活化的腺苷酸環(huán)化酶催化ATP水解生成。cAMP將激素或遞質的調節(jié)信號傳遞到胞內有關細胞器，產(chǎn)生一系列的生物效應［3］。cAMP的生理功能必須通過其依賴的蛋白激酶 A來實現(xiàn)。蛋白激酶主要是催化體內蛋白質磷酸化的酶類，而蛋白磷酸化則是體內各種生物反應最終起作用的關鍵。PKA作為cAMP依賴性蛋白激酶，是整個cAMP作用的分子基礎。當cAMP不存在時，PKA以無活性的全酶狀態(tài)存在，當PKA的調節(jié)亞基與cAMP結合時，PKA得以活化［4-5］，cAMP與PKA的調節(jié)亞基結合后可導致催化亞基的釋放，并轉位至細胞核內，可以進一步使 CREB在 Ser133磷酸化，進而影響CREB的轉錄活性［6-8］。

目前，已有對于脾虛證與cAMP-PKA信號傳導通路的相關研究［9-10］，而本研究則側重檢測cAMP-PKA信號傳導通路的相關分子。實驗結果顯示，與正常組比較，脾氣虛組和脾陽虛組大鼠胃組織cAMP的活性均有所減低，同時2組PKA mRNA和蛋白表達也有所下降，CREB mRNA和蛋白表達的改變與cAMP、PKA改變是一致的，說明在脾氣虛證大鼠造模的過程中，cAMP-PKA信號傳導通路被激活。但從實驗結果也可以看出，脾氣虛證組與脾陽虛證組僅在某些檢測指標中存在統(tǒng)計學意義，因此在這2種造模方式中，哪種造模與cAMP-PKA信號傳導通路的關系更為密切，尚不能確定。且信號傳導通路非常復雜，而對于脾虛證造模后其他組織和臟器的改變也需要更進一步的研究，以對脾虛證的發(fā)病機制進行更詳盡的探討。

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Study on the cAMP－PKA Signal Transduction Pathway Change in the Gastric Tissue of Spleen Deficiency Rats

SONG Nan，JIA Lian-qun，WANG Jun-yan，SHAN De-hong，HE Li-juan，CAO Yuan，ZHU Mei-lin，YANG Guan-lin△
(Key Laboratory of Ministry of Education for TCM Viscera-State Theory and Applications，Ministry of Education of China(Province-Ministry Co-construct)，Shenyang 110847，China)

Objective:To discuss the changes and relative protein of cAMP-PKA signaling pathway in the gastric tissue in spleen deficiency rats.Methods:24 male SD SPF rats were randomly assigned into three groups，and control group，spleen Qi deficiency group and spleen Yang deficiency group.The modeling method of spleen Qi deficiency rats was repletion 1 day，fasting 2 days，then swimming for 15 days.The modeling method of spleen Yang deficiency rats was the same as the spleen Qi deficiency rats，and gavaging the water of Folium sennae in addition.Then tested the cAMP activity and PKA、CREB mRNA and protein expression of the gastric tissue.Results:The gastric tissue cAMP activity and PKA、CREB mRNA and protein expression of both spleen Qi deficiency rats and spleen Yang deficiency rats were decreased，and the spleen Yang deficiency rats were more obvious.Conclusion:There is relevance between the process of building spleen Qi deficiency and spleen Yang deficiency rats modeling and the cAMP-PKA signaling pathway in the gastric tissue.

Spleen Qi deficiency syndrome;Spleen Yang deficiency syndrome;cAMP/PKA;Signal transduction

R285.6

B

1006-3250(2015)06-0653-03

2015-02-26

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(“973”計劃)資助項目(201133CB531700)

宋 囡(1981-)，女，遼寧人，實驗師，醫(yī)學博士，從事中醫(yī)藥防治心血管疾病的機制研究。

△通訊作者:楊關林，Tel:024-31207046，E-mail:yang_ guanlin@163.com。