附子注射液對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織的影響

裴河歡，唐漢慶，李曉華，李克明，朱曉瑩

(1．欽州市中醫(yī)藥研究所，廣西欽州 535000;2．右江民族醫(yī)學院，廣西百色 533000)

附子注射液對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織的影響

裴河歡1，唐漢慶2△，李曉華2，李克明2，朱曉瑩2

(1．欽州市中醫(yī)藥研究所，廣西欽州 535000;2．右江民族醫(yī)學院，廣西百色 533000)

目的:觀察附子注射液對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織的影響，為附子的拓寬應用提供實驗學基礎資料。方法:60只清潔級Wistar雌性大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、附子注射液低劑量、中劑量、高劑量組、雌二醇組6組，模型組、低劑量、中劑量、高劑量組、雌二醇組切除卵巢。低劑量、中劑量、高劑量組、雌二醇組再分別以附子注射液尾靜脈注射(iv)，正常組、模型組則分別給予同體積的生理鹽水。檢測血清鈣、磷、骨密度(BMD)、子宮質量指數、骨小梁厚度、骨小梁間距并觀察骨形態(tài)學變化。結果:與正常組比較，模型組血清鈣、磷水平、骨小梁間距均顯著升高，而BMD、子宮質量指數、骨小梁厚度均顯著降低。與模型組比較，高劑量組、雌二醇組血清鈣、磷水平、骨小梁間距均降低，而BMD、骨小梁厚度升高，且雌二醇組子宮質量指數顯著升高。結論:附子注射液和雌二醇均能改善骨質疏松癥，其中高劑量附子注射液對子宮的刺激作用較雌二醇溫和，其機制需要更多實驗研究。

附子注射液;骨質疏松癥;卵巢切除術;骨密度

中醫(yī)學認為，附子具有補火助陽、溫腎散寒等功效，對心脾腎陽虛證均具有振奮作用，是助陽名藥。對附子的研究以往多集中于心血管系統(tǒng)。近來有研究［1］表明，其功效的發(fā)揮與垂體-腎上腺-性腺軸有聯系。骨質疏松癥(osteoporosis，OP)以低骨量、骨組織的微觀結構損害為特征，是造成骨折的高風險因素之一，被認為是一種起病隱匿的慢性病。［2］37如何進行有效的防治是值得探討的課題。根據中醫(yī)學“腎主骨”的理論述說，參考有關附子等補陽方劑與垂體-腎上腺-性腺軸的研究［3-4］，我們推測附子溫腎助陽作用也有可能對骨組織代謝有一定的影響。鑒于去卵巢動物骨質疏松模型與臨床絕經后骨質疏松癥表現相似度較高，這一造模方法目前也比較得到認同［5］，因此我們試圖建立大鼠骨質疏松模型，以附子注射液作為干預藥物觀察其對模型大鼠骨組織的影響，為附子拓寬應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級Wistar雌性大鼠60只，體質量210～260 g，本院科學實驗中心提供(動物合格證號SCXK(桂)2012-0007)。

1.1.2 藥物和試劑 附子注射液(自制);戊巴比妥鈉(批號20110621，北京化學試劑公司);雌二醇注射液(批號080401，上海通用藥業(yè));血清鈣試劑盒(批號00321101，北京博奧公司);磷試劑盒(批號120343121，北京博奧公司)。

1.1.3 儀器 普利賽斯電子天平(XT220A型，上海麥聚瑞電子儀器有限公司);生物顯微鏡(DM1000，萊卡);電腦快速恒冷冷凍石蠟兩用切片機(KD-2258-VI型，浙江科迪);高速低溫離心機(PK121R型，ALC公司);雙能X線骨密度測定儀(DCS-600R型，Aloka，Japan);中草藥粉碎機(DXF-1000A型，廣州大祥);智能放免測量儀(SN-695B型，上海核所日環(huán)光電儀器有限公司);自動生化分析儀(RTX-90，Beckman，USA)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和造模 60只清潔級Wistar雌性大鼠適應性喂養(yǎng)1周后按隨機數字表法分為正常組、模型組和附子低、中、高劑量組、雌二醇組6組各10只。其中模型組、附子低、中、高劑量組、雌二醇組均施行卵巢切除手術［6］:仰臥位2%戊巴比妥鈉大鼠腹腔注射(40 mg·kg－1)麻醉，嚴格無菌操作下正中腹部切口，鈍性分離肌肉組織和腹膜，沿輸卵管上行查尋卵巢，應用7號手術縫線在輸卵管壺腹處進行結扎，完整切除雙側卵巢后撒上青霉素粉，縫合皮膚并消毒傷口。正常組手術路徑相同但不切除卵巢，只用鑷子輕輕夾出卵巢再送回縫合關腹。術后均連續(xù)灌服青霉素3 d，以預防感染。術后均普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。術后恢復2周后附子低、中、高劑量組和雌二醇組分別以附子注射液(5、10、20 g·kg－1)、雌二醇注射液(0.05 g·kg－1)尾靜脈注射(iv)，正常組、模型組則分別給予同體積生理鹽水。每天1次，連續(xù)靜脈注射8周。8周后第1天禁食12 h取材檢測。

考慮到附子對心血管系統(tǒng)的副作用，對附子注射液劑量我們參考研究確定的靜脈注射半數致死量(LD50)［7］和研究［8］單體藥物人體實驗與動物實驗給藥劑量間等效劑量情況進行折算而確定，將附子注射液劑量定在安全范圍內。對雌二醇計量參考研究［8］而確定。

1.2.2 附子注射液制備 熟附片由本校藥理教研室提供并鑒定。參考沈陽藥學院藥物制劑組《常用藥物制劑》酒精沉淀法制備100%附子注射液，即每100 mL中含有100 g生藥成分。

1.2.3 血清鈣、磷測定 心臟取血5mL離心(4℃，2000 r·min－1，10 min)取上清液，－80℃保存，分別按照試劑盒說明書進行操作檢測。

1.2.4 骨密度(bone mineral density，BMD)測定 應用雙能X線骨密度測定儀和軟件進行大鼠左股骨掃描并測定BMD值。

1.2.5 子宮質量指數測定 取材前大鼠稱重，處死后取大鼠子宮，輕壓擠出子宮液體，濾紙吸干稱重。為避免大鼠個體質量差異對實驗的影響，以子宮質量指數為指標，按下列公式計算:子宮質量指數=大鼠子宮質量/大鼠質量。

1.2.6 骨組織形態(tài)學觀察 大鼠處死后取右股骨，剔除肌肉筋膜組織稱重，4%多聚甲醛固定48 h，10%EDTA-2Na溶液脫鈣4周，pH7.4的PBS沖洗2次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、組織切片厚度5 μm，HE染色，生物顯微鏡、自動圖像分析儀觀察并拍片，進行骨組織計量分析，計算骨小梁厚度和骨小梁間距。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠術后2～3 h后意識完全清醒，可正常進食。48 h后切口無紅腫，可正?；顒?，72 h后切口無感染。全部大鼠2周后切口均I期愈合，實驗中途沒有死亡脫失，均納入統(tǒng)計分析。

2.2 大鼠血清鈣、磷、BMD及子宮質量指數測定

表1顯示，與正常組比較，模型組血清鈣、磷水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而BMD及子宮質量指數均顯著降低，差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與模型組比較，低劑量、中劑量組鈣、磷水平均降低，BMD及子宮質量指數均升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)，而高劑量組血清鈣、磷水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);BMD顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，子宮質量指數也升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)。與模型組比較，雌二醇組血清鈣、磷水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而BMD升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，子宮質量指數顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。高劑量組和雌二醇組各項指標比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 血清鈣、磷、BMD及子宮質量指數比較(±s)

表1 血清鈣、磷、BMD及子宮質量指數比較(±s)

注:與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組 別 例數 劑量/g·kg－1血清鈣/mmol·L－1血清磷/mmol·L－1BMD/g·cm2子宮質量指數正 常 組 10 —2.76±0.54 1.87±0.84 0.94±0.04 0.23±0.02 模 型 組 10 — 5.56±0.892)4.58±0.922)0.18±0.012)0.09±0.012)低劑量組 10 5 4.18±0.66 4.22±0.81 0.23±0.05 0.13±0.02中劑量組 10 10 4.09±0.72 3.86±0.86 0.34±0.06 0.14±0.01高劑量組 10 20 2.98±0.524)2.03±0.764)0.88±0.044)0.16±0.04雌二醇組 10 0.05 2.82±0.494)2.45±0.684)0.76±0.053)0.34±0.054)

2.3 大鼠骨小梁厚度、骨小梁間距測定結果

表2顯示，與正常組比較，模型組骨小梁厚度顯著減少，骨小梁間距顯著增大，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與模型組比較，低劑量、中劑量組骨小梁厚度增大，骨小梁間距減小，但差異無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)，而高劑量組骨小梁厚度顯著增大，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，骨小梁間距減小，差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與模型組比較，雌二醇組骨小梁厚度增大，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);骨小梁間距減小，差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。高劑量組和雌二醇組骨小梁厚度、骨小梁間距比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.4 骨組織形態(tài)學觀察

正常組股骨骨小梁粗壯，分布均勻密集，形態(tài)結構完整，連接成網狀，骨髓細胞較多，腔大小正常。模型組骨小梁稀疏、斷裂，排列雜亂，骨髓腔擴大，有空泡存在。

低劑量、中劑量組骨小梁稀疏、斷裂，也有空泡存在，而高劑量組和雌二醇組骨小梁排列致密，骨髓腔骨髓細胞較多(見圖1～6)。

表2 骨小梁厚度、骨小梁間距比較(±s)

表2 骨小梁厚度、骨小梁間距比較(±s)

注:與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組 別 例數 劑量/g·kg－1骨小梁厚度/mm骨小梁間距/mm正常組 10 —42.52±6.82 0.16±0.02模型組 10 — 20.22±3.342)0.36±0.062)低劑量 10 5 22.87±4.56 0.34±0.08中劑量 10 10 26.78±5.16 0.32±0.05高劑量 10 20 50.65±8.844)0.21±0.043)雌二醇 10 0.05 38.36±6.223)0.22±0.033)

圖1 正常組(HE×100)

圖2 模型組(HE×100)

圖3 低劑量組(HE×100)

圖4 中劑量組(HE×100)

圖5 高劑量組(HE×100)

圖6 雌二醇組(HE×100)

3 討論

去卵巢動物骨質疏松模型與臨床絕經后骨質疏松癥表現吻合度較高，骨代謝的正常是骨吸收和骨形成2個過程維持平衡的結果［9］，這2個過程與破骨細胞和成骨細胞的功能狀態(tài)相關，如果破骨細胞功能亢進，增加對骨的吸收，從而引起骨中鈣磷的流失，導致骨礦物質的減少，表現為BMD的減小、血清鈣磷水平的升高［10］。研究［11-12］已表明，卵巢切除后引起大鼠骨量減少，是由于雌激素不足引起破骨細胞功能相對亢進、骨吸收大于骨形成而致。

在本實驗中我們觀察到，與正常組比較，模型組血清鈣、磷水平均顯著升高，而BMD顯著降低，骨小梁厚度顯著減少，骨小梁間距顯著增大。骨形態(tài)學也觀察到，骨小梁稀疏、變細，排列雜亂，骨髓腔擴大，說明模型組雌激素不足出現骨代謝異常表現。采用附子注射液和雌二醇干預后，上述指標或異常表現在一定程度上得到糾正或恢復。這一效果與附子注射液的劑量有關。低劑量和中劑量組改善效果不明顯，而以高劑量組改善效果顯著，使各項指標接近或趨向正常組水平，提示單味中藥如果要臨床取效可能需要較大用量，這與一些中藥復方的效果好、用量精有不同之處［13］，推測與中藥復方作用于多環(huán)節(jié)和多通路有關。

附子注射液和雌二醇均能改善骨質疏松癥骨組織異常表現，但兩者的作用還稍有不同。單就本實驗工作而言，我們注意到與模型組比較，雌二醇組子宮質量指數顯著升高，附子注射液3個劑量組盡管子宮質量指數也升高，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，說明盡管附子注射液對子宮也有刺激作用，但作用較雌二醇溫和。這一點提示我們，長期應用雌激素防治骨質疏松癥有可能存在刺激子宮組織增生、有潛在致瘤風險。如果能找到一種對子宮刺激作用微弱而又有效治療骨質疏松癥的藥物，就有可能使女性絕經后骨質疏松癥的治療變得更安全有效，并有可能成為長期使用的預防藥物。關于附子注射液和雌二醇對子宮不同程度的刺激作用，我們推測可能與雌激素受體不同的亞型有關。研究表明，不同的亞型對子宮的刺激作用不同［14］，因此對于附子注射液是否通過不同亞型起作用值得進一步的探究。

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Effects of aconite injection on bone tissue in osteoporotic rats

PEI He-huan1，TANG Han-qing2△，LI Xiao-hua2，LI Ke-ming2，ZHU Xiao-ying2
(1．Chinese Medical research institute of Qinzhou city，Guangxi Qinzhou 535000，China; 2．Youjiang Medical University for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China)

Objective To observe effects of Fuzi injection on bone tissue in ovariectomized rats with osteoporosis for further applicatioin of Fuzi．Methods 60 clean grade female Wistar rats were randomly divided into control group，model group，Fuzi injection low-dose，middle-dose，high-dose group and estradiol group 6 groups．Model group，Fuzi injecton 3 groups and estradiol group have been ovariectomized to establish model of osteoporosis，and then Fuzi injecton 3 groups and estradiol group respectively were iv Fuzi injection and estradiol．control group and model group were iv the same volume normal saline．To examine levels of serum calcium and phosphorus，bone mineral density(BMD)，uterus index，trabecular thickness，trabecular space and changes of bone morphology．Results:Compared with control group，levels of serum calcium，phosphorus and trabecular space in model group increased significantly while BMD，uterus index and trabecular thickness reduced significantly．Compared with model group，levels of serum calcium，phosphorus and trabecular space in both high-dose group and estradiol group reduced while BMD and trabecular thickness increased，in additon，uterus index in estradiol group increased significantly．Conclusion:It was suggested that both Fuzi injection and estradiol might improve bone tissue of osteoporosis while high-dose Fuzi injection had a milder stimulating effect on uterus than that of estradiol，whose mechanism was needed more experimental researches．

Fuzi injection;Osteoporosis;Ovariectomy;Bone mineral density

R285．6

B

1006-3250(2015)03-0278-04

2014-11-13

裴河歡(1981-)，男，藥師，從事中醫(yī)藥的臨床與研究。

△通訊作者:唐漢慶(1976-)，男，副教授，從事中西醫(yī)結合及民族醫(yī)藥研究，Tel:18978603776，E-mail:phdtanghanqing@ 163．com。