高羊茅黔草1 號SAMDC 基因的克隆及植物表達載體的構建

曾慶飛，楊春燕，李小冬，吳佳海，王小利

( 1． 貴州省草業(yè)研究所，貴州貴陽550006; 2． 貴州陽光草業(yè)科技有限責任公司，貴州貴陽550006)

S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(SAMDC)是一個在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用的抗逆相關基因［1-3］。SAMDC 是植物多胺生物合成途徑中的一個關鍵酶，該酶以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為底物催化形成脫羧S-腺苷甲硫氨酸(dcSAM)，為精氨和亞精氨的合成提供氨丙基，是亞精胺和精胺合成的限速酶［4］。迄今為止，已從生菜(Lactuca sativa)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、水稻(Oryza sativa)、芥菜型油菜(Brassica juncea)、番茄(Lycopersicon esculentum)等植物中克隆出SAMDC 編碼基因［5］。

通過超量表達SAMDC 基因來提高農(nóng)作物的抗鹽、抗高溫、抗旱性研究在國外已有不少成功的先例。Bhavna 和Manchikatla［6］將人類SAMDC 基因?qū)霟煵?Nicotiana tabacum)，煙草內(nèi)源腐胺和亞精胺含量顯著升高，植物耐鹽性和滲透性提高。Cheng等［7］將酵母SAMDC 基因轉(zhuǎn)入番茄，轉(zhuǎn)基因植株亞精胺和精胺含量升高，且植株對高溫脅迫表現(xiàn)明顯抗性。Momtaz 等［8］將酵母的SAMDC 基因通過基因槍法轉(zhuǎn)化莖尖導入棉花(Gossypium hirsutum)Giza88和Giza90，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中精胺水平顯著提高，耐旱性增強。Zhao 等［9］通過融合GUS 蛋白對Md-SAMDC2 啟動子進行定位分析和逆境脅迫誘導表達分析，GUS 活性在鹽和低溫脅迫下上升表達，表明SAMDC 啟動子控制著逆境條件下的基因表達。

在國內(nèi)，李昌澎等［10］以小麥(Triticum aestivum)品種“晉麥47”為材料，利用半定量RT-PCR方法，對SAMDC 基因在正常供水、PEG-6000 模擬水分脅迫和復水過程中小麥葉片的表達模式進行了分析。結果表明，小麥SAMDC 基因的表達受水分脅迫誘導。同時，SAMDC 基因還參與水分脅迫后的復水調(diào)節(jié)，說明S-腺苷甲硫氨酸代謝途徑在小麥抗旱節(jié)水中具有重要作用。陸俊杏等［11］對甘藍型油菜(Brassica napus)的SAMDC3 基因及其啟動子進行了克隆分析，表明SAMDC3 可能通過ABA、6-BA 和SA 信號途徑介導植物對非生物脅迫的響應。眾多研究已證實SAMDC 是參與抗旱響應和受鹽脅迫誘導的抗逆功能基因，植物SAMDC基因的研究與利用正逐漸受到重視［6］。本研究克隆了貴州省草業(yè)研究所自主育成的高羊茅新品種“黔草1 號”(Festuca arundinacea cv． Qiancao No．1)的SAMDC 基因，并針對高羊茅和黑麥草(Lolium perenne)組培再生系統(tǒng)對特定抗生素的敏感特性，構建了適合于單子葉禾本科牧草特別是高羊茅和黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化的植物過量表達載體，以期通過下一步的遺傳轉(zhuǎn)化培育出禾草抗逆種質(zhì)新材料。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 植物材料 高羊茅“黔草1 號”由貴州省草業(yè)研究所于2005 年育成并保存。

1．1．2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、JM109 購自TAKARA 公司，農(nóng)桿菌GV3101、EHA105 和改造過的pCAMBIA1300 載體由貴州省農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)研究所分子生物學實驗室保存。

1．1．3 酶和化學試劑 植物總RNA 提取試劑盒、pGM-T 平末端DNA 片段加A 試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;cDNA 合成試劑盒購自Clontech 公司;限制性內(nèi)切酶、T-DNA 連接酶購自Thermo Scientific 公司;DNA 片段回收試劑盒、潮霉素、卡那霉素、氨芐青霉素等購自生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑均為分析純。

1．2 試驗方法

1．2．1 高羊茅總RNA 的提取及cDNA 的合成 高羊茅“黔草1 號”葉片總RNA 的提取按照天根公司的總RNA 提取試劑盒操作步驟進行;以提取的RNA 為模板，按照Clontech cDNA 擴增試劑盒的操作說明合成cDNA 第一鏈。

1．2．2 目的基因的克隆與序列分析 根據(jù)Gen-Bank 上所登錄的高羊茅SAMDC 基因序列，采用Primer Premier 5 軟件設計一對引物FaSF/R，用于擴增高羊茅SAMDC 基因的全長CDS。并根據(jù)載體pCAMBIA1300 的結構特點，在引物的5'端分別加上KpnI 和PstI 酶切位點，引物序列為，F(xiàn)aSFwd1:5'-CGGGGTACCAAAATCCGTAAACTCGTCG-3'; FaSRev1: 5'-ACGCTGCAGCCTAGAGCCAACAATAGTTTAT-3'。

擴增產(chǎn)物大小為1 821 bp。以高羊茅“黔草1號”cDNA 為模板，用FaSF/R 引物擴增高羊茅SAMDC 基因的全長CDS。PCR 反應采用Thermo Fisher公司的Thermo Scientific Phusion 高保真DNA 聚合酶進行擴增。通過平末端DNA 片段加A 試劑盒在純化的PCR 產(chǎn)物3'末端加A 后與pGM-T 連接，得到pGM-T-FaSAMDC 重組質(zhì)粒，通過熱激法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 中，挑選陽性克隆送大連寶生物有限公司測序。

1．2．3 SAMDC 基因表達載體的構建

1)酶切反應:在一滅菌的EP 管中依次加入10 ×Tango Buffer 2 μL、改造后的pCAMBIA1300 或pGM-T-FaSAMDC 15 μL、KpnI 2 μL、PstI 1 μL，輕輕混勻，瞬時離心，37 ℃水浴3 h，60 ℃滅活15 min 終止反應。瓊脂糖凝膠電泳，DNA 片段回收試劑盒回收目的片段。

2)連接反應:在一滅菌的EP 管中依次加入經(jīng)雙酶切后回收的pCAMBIA1300 2 μL、經(jīng)雙酶切后回收的FasAMDC 8 μL、滅菌去離子水7 μL、10 ×連接Buffer 2 μL，45 ℃水浴5 min 后加入T4-DNA 連接酶1 μL，混勻于16 ℃條件下過夜。

3)轉(zhuǎn)化及鑒定:取10 μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB 瓊脂平板上，挑選陽性單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，少量抽提質(zhì)粒，用PCR 及雙酶切進行鑒定。

1．2．4 根癌農(nóng)桿菌重組質(zhì)粒的導入 取5 μL pCAM-SAMDC 過表達載體，分別加入200 μL 根癌農(nóng)桿菌GV3101 和EHA105 感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴15 min;轉(zhuǎn)入液氮冷凍l min，迅速置37 ℃水浴鍋溫浴5 min;加入400 μLYEB 液體培養(yǎng)基，28 ℃250 r·min－1預表達4 ～5 h;取適當體積均勻涂布于含有抗生素的YEB 平板，28 ℃培養(yǎng)2 d，待長出單菌落后挑取單克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并進行PCR 和酶切驗證，將陽性克隆加15%的甘油置于－70 ℃冰箱中保存。

2 結果

2．1 目的片段的克隆與序列分析

2．1．1 FaSAMDC 基因cDNA 片段的擴增與回收

以反轉(zhuǎn)錄合成的高羊茅“黔草1 號”cDNA 為模板，利用設計合成的引物FaSFwd1 和FaSRev1 進行PCR 擴增，得到預期約1 821 bp 的條帶(圖1)，采用DNA 膠回收試劑盒純化回收PCR 產(chǎn)物。

圖1 高羊茅“黔草1 號”的SAMDC 基因擴增Fig．1 Amplification of SAMDC geng from Qiancao No． 1

2．1．2 基因的克隆與序列分析 通過平末端DNA片段加A 試劑盒在純化的PCR 產(chǎn)物3'末端加A 后與pGM-T 連接，得到pGM-T-FaSAMDC 重組質(zhì)粒，通過熱激法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 中，挑選陽性克隆送大連寶生物有限公司測序?；驕y序分析表明，包括引物的擴增片段共1 835 個核苷酸，包含有9 bp 的微型上游閱讀框、147 bp 的小型上游閱讀框和1 185 bp 的主閱讀框。微型上游閱讀框和小型上游閱讀框存在一個堿基重疊。整個克隆片段與GenBank 上公布的高羊茅SAMDC 基因的核苷酸同源性為95．05%。

2．1．3 克隆基因氨基酸序列的推導與分析 采用DNAMAN 軟件推導得出，擴增的SAMDC 基因主閱讀框編碼395 個氨基酸，與GenBank 登錄的FaSAMDC 基因編碼的氨基酸數(shù)量相同，同源性為98．22%，說明克隆的“黔草1 號”的SAMDC 基因與注冊的高羊茅FaSAMDC 基因存在著微小的差異。

2．2 SAMDC 基因植物表達載體的構建

根據(jù)克隆出的FaSAMDC 基因核苷酸的序列特征，選擇經(jīng)貴州省草業(yè)研究所分子生物學實驗室改造后的pCAMBIA 1300 作為表達載體。用KpnI 和PstI 雙酶切pGM-T-FaSAMDC 重組質(zhì)粒，回收1．8 kb的SAMDC 基因片段，與經(jīng)KpnI 和PstI 雙酶切回收的pCAMBIA 1300 大片段連接，獲得重組質(zhì)粒pCAM-SAMDC。

用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109 感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆培養(yǎng)抽提質(zhì)粒，以提取的重組質(zhì)粒為模板，采用與擴增FaSAMDC 基因相同的引物和體系進行PCR 鑒定，結果擴出了1．8 kp 的目的片段(圖2);用KpnI 和PstI 雙酶切重組質(zhì)粒pCAM-SAMDC，得到8．9 和1．8 kb 的兩條片段(圖3)，說明pCAM-SAMDC 為本文需要的過表達載體，接下來重組質(zhì)粒部分序列的測定結果進一步證明了表達載體構建的正確性。構建出的過表達載體結構如圖4 所示。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR 鑒定Fig．2 Identification of recombinant plasmids with PCR

圖3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig．3 Analysis of recombinant plasmid with restriction enzyme

2．3 重組質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌株

通過凍融法將構建的重組質(zhì)粒pCAM-SAMDC導入根癌農(nóng)桿菌GV3101 和EHA105 菌株中，提取2個轉(zhuǎn)化后的根癌農(nóng)桿菌菌株的質(zhì)粒，經(jīng)PCR 擴增都獲得了1．8 kb 的目的片段(圖5)，證明構建的過表達載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株中，為下一步通過農(nóng)桿菌介導法將SAMDC 基因?qū)牒瘫究颇敛莸於嘶A。

圖4 構建的植物表達載體結構簡圖Fig．4 The structural diagram of constructed plant expression vector

圖5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌株的PCR 鑒定Fig．5 Identification of transmitted Agrobacterium tumefacien strains with PCR

3 討論與結論

高羊茅、黑麥草等草種是世界上廣泛栽培的重要冷季型禾草，在我國很多地區(qū)被大量引進種植，其株型外觀優(yōu)美，植株營養(yǎng)豐富、耐踐踏，具有作為牧草和草坪草的很多優(yōu)點，但在草地草坪建植過程中也存在著一些缺點，如不耐高溫、干旱及高鹽等非生物脅迫［12］，通過轉(zhuǎn)入可利用的抗性基因來提高它們的抗性具有重要的生產(chǎn)意義。

S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(SAMDC)是一個在植物多胺合成途徑中起著重要調(diào)節(jié)作用的抗逆相關基因。SAMDC 基因表達受高鹽、高熱、干旱及寒冷的誘導，但不受植物創(chuàng)傷的影響，說明SAMDC 能對多種環(huán)境條件的脅迫作出反應［13］。Wi 等［14］在煙草中過量表達康乃馨的SAMDC 能讓轉(zhuǎn)基因植株獲得對非生物脅迫的廣譜抗性;Peremarti 等［15］研究證明，SAMDC 調(diào)節(jié)合成的精胺積累有助于植物在經(jīng)受干旱后的快速復蘇;Hazarika 和Rajam［16］的試驗還證明，轉(zhuǎn)基因番茄中SAMDC 基因的組成型表達同時提高了植株對生物及非生物脅迫的耐受性。Lasanajak 等［17］將酵母SAMDC 基因轉(zhuǎn)入番茄，結果在果實中觀察到多胺生物合成流量的增加，而乙烯的生成減少。Wi 等［18］最近發(fā)現(xiàn)，除調(diào)節(jié)多胺的生物合成外，SAMDC 還能通過抑制活性氧的積累來增強擬南芥對干旱的耐受性。

植物的SAMDC 基因存在著序列結構的多態(tài)性。本研究從高羊茅“黔草1 號”葉片中擴增SAMDC 基因時，采用高保真DNA 聚合酶平末端擴增法，以最大程度降低堿基的錯配率?？寺〕龅腟AMDC基因包括引物序列共有1 835 個核苷酸，包含有9 bp 的微型上游閱讀框、147 bp 的小型上游閱讀框和1 185 bp 的主閱讀框，微型上游閱讀框和小型上游閱讀框存在一個堿基重疊，這與葡萄(Vitis vinifera)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、大豆中的SAMDC基因上游閱讀框的結構特征相同。Tassoni 等［3］將去除上游2 個微小讀碼框的葡萄SAMDC cDNA 片段導入酵母細胞內(nèi)表達，結果顯示SAMDC 酶的活性比完整片段的酶活性要高出50 倍之多，說明SAMDC 基因上游的2 個微小讀碼框具有很強的調(diào)節(jié)功能。本研究克隆出的高羊茅“黔草1 號”SAMDC 基因主閱讀框編碼395 個氨基酸，這與GenBank登錄的FaSAMDC 基因編碼的氨基酸數(shù)量一致，但與大豆GmSAMDC1 基因編碼355 個氨基酸的片段長度差異較大［13］。

本研究構建SAMDC 基因植物表達載體的目的是針對黑麥草和高羊茅的遺傳轉(zhuǎn)化。高羊茅與黑麥草的胚性愈傷組織對卡那霉素、頭孢霉素等抗生素較為敏感，選用潮霉素作為篩選抗生素能明顯提高陽性株系的出苗率［19-20］。本研究選擇經(jīng)貴州省草業(yè)研究所分子生物學實驗室改造過的pCAMBIA1300 作為表達載體，一方面，能將插入的SAMDC 基因直接置于35S 啟動子之下，另一方面，可用潮霉素作為遺傳轉(zhuǎn)化時的篩選抗生素，以增加轉(zhuǎn)基因株系的獲得率。成功構建的pCAM-SAMDC 過表達載體，為下一步通過遺傳轉(zhuǎn)化手段培育黑麥草和高羊茅的抗旱、耐熱、耐鹽新品系奠定了物質(zhì)基礎。

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