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    絕經(jīng)前后三陰性乳腺癌患者差異蛋白分析

    2015-04-09 11:14:50梁金龍張健莉羅守娟
    中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2015年2期
    關(guān)鍵詞:三陰性乳腺癌

    梁金龍+++張健莉+++羅守娟+等

    [摘要] 目的 應(yīng)用iTRAQ技術(shù)分析絕經(jīng)前后三陰性乳腺癌組織差異蛋白的表達(dá)情況,旨在探討絕經(jīng)對(duì)三陰性乳腺癌發(fā)生的影響。 方法 選擇絕經(jīng)前及絕經(jīng)后各8例經(jīng)病理確診的三陰性乳腺癌患者,應(yīng)用iTRAQ技術(shù)分析差異蛋白顯著性功能、差異蛋白pathway并進(jìn)行差異蛋白驗(yàn)證。 結(jié)果 (1)絕經(jīng)前差異蛋白相互作用組較集中,而絕經(jīng)后的差異蛋白較多,且分布較散。(2)絕經(jīng)前癌組織的差異蛋白存在于5種差異顯著途徑中;絕經(jīng)后癌組織的差異蛋白存在于15種差異顯著途徑中。(3)與癌旁組織相比,絕經(jīng)前共有214種顯著差異蛋白,絕經(jīng)后共有360種顯著差異蛋白。絕經(jīng)前的三陰性乳腺癌組織中上調(diào)蛋白81種,下調(diào)蛋白133種,絕經(jīng)后上調(diào)蛋白157種類(lèi),下調(diào)203種。 結(jié)論 利用iTRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn),絕經(jīng)前后三陰性乳腺癌患者差異蛋白表達(dá)具有一定的特殊性,說(shuō)明不同雌激素環(huán)境下三陰性乳腺癌可能存在不同發(fā)病機(jī)制,可能成為治療TNBC的新靶點(diǎn)。

    [關(guān)鍵詞] 三陰性乳腺癌;絕經(jīng)前后; iTRAQ技術(shù);差異蛋白

    [中圖分類(lèi)號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2015)02-0001-04

    三陰性乳腺癌(TNBC)是指孕激素受體(progesterone receptor,PR)、雌激素受體(estrogen receptor,ER)和人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2,Her-2)均為陰性表達(dá)的乳腺癌,其多發(fā)于初潮及足月懷孕年齡早、哺乳期短,特別是絕經(jīng)前的婦女[1]。目前手術(shù)、化療及新輔助化療和靶向治療為常用治療TNBC方法。其中分子靶向治療以腫瘤細(xì)胞的特征性改變?yōu)樽饔冒悬c(diǎn),在發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用的同時(shí)減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。目前TNBC治療靶點(diǎn)的篩查工作已取得了一定的研究進(jìn)展,其中差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法被認(rèn)為是目前篩選TNBC臨床治療靶點(diǎn)最為有效的研究方法之一。差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法主要包括雙向凝膠電泳、雙向熒光差異凝膠電泳、高效液相色譜技術(shù)、應(yīng)用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)等分離技術(shù)及質(zhì)譜鑒定技術(shù)[2]。近年來(lái)人們對(duì)iTRAQ技術(shù)的應(yīng)用日漸開(kāi)展起來(lái),然而將iTRAQ技術(shù)應(yīng)用于三陰性乳腺癌機(jī)制研究及靶向位點(diǎn)的探討至今仍較少。本研究以絕經(jīng)前和絕經(jīng)后三陰性乳腺癌患者癌組織和癌旁正常組織為實(shí)驗(yàn)材料,利用iTRAQ技術(shù)分析絕經(jīng)前和絕經(jīng)后三陰性乳腺癌和癌旁正常組織蛋白差異表達(dá)譜,進(jìn)而分析絕經(jīng)前和絕經(jīng)后差異蛋白的特異性,旨在探討絕經(jīng)對(duì)三陰性乳腺癌發(fā)生產(chǎn)生的影響,從而為三陰性乳腺癌的治療提供依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料

    選擇2013年1月~2014年1月間我院收治的絕經(jīng)前及絕經(jīng)后各8例經(jīng)病理確診的三陰性乳腺癌患者,病理類(lèi)型均為導(dǎo)管腺癌。絕經(jīng)前8例TNBC患者的年齡范圍為40~53歲。絕經(jīng)后8例TNBC患者的年齡范圍為59~81歲。16例三陰性乳腺癌患者的病例資料見(jiàn)表1。

    1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

    1.2.1 SDS-PAGE (1)組織標(biāo)本處理:取術(shù)后新鮮的乳腺癌組織及距腫瘤5 cm以上的癌旁正常乳腺組織,切成小塊,稱重,分裝,置-80℃的低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。?)總蛋白制備:①取50 μg低溫冷凍的樣品置于液氮預(yù)冷的研缽中,邊加入液氮邊研磨,直至樣品呈現(xiàn)白色粉末狀,收集到1.5 mL的EP管中。②加入500 μL LS,振蕩器混勻,超聲波破碎,重復(fù)3次,每次間隔3 min。③置冰上1 h,并間歇震蕩。④4℃,15 000 rpm離心30 min,重復(fù)2次,樣品分層后用移液器小心地將中層清液吸出放入1.5 mL EP管中。⑤向中清液加入丙酮/甲醛沉淀液,冰上沉淀2 h。⑥4℃,15 000 rpm離心20 min,棄上清,加入1 mL 100%丙酮,置于-20℃冰箱中沉淀1 h。⑦加入80%丙酮1 mL,-20℃冰箱中沉淀1 h,4℃,15 000 rpm離心15 min,留取沉淀,在空氣中晾干。⑧將250 μL 加入RS晾干沉淀,渦旋振蕩器上混勻,30℃金屬浴中孵育1 h。⑨4℃,15 000 rpm離心10 min,留取上清,即為組織總蛋白溶液。(3)總蛋白濃度測(cè)定:①準(zhǔn)備兩組8個(gè)1.5 mL離心管,每管各加入0、5、7.5、10、12.5、15、17.5和20 μL 0.5 mg/mL牛血清白蛋白,再分別加入20、15、12.5、10、 7.5、5、2.5、0 μL蛋白溶解液,再加入80 μL 0.15 mmol/L NaCl,以1號(hào)管不含牛血清白蛋白的作空白對(duì)照。②每管各加入1 mL考馬斯亮藍(lán)染料溶液。③比色測(cè)OD595。(4)SDS-PAGE:①準(zhǔn)備SDS-PAGE凝膠。②將樣品與SDS樣品緩沖液混合,同樣準(zhǔn)備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物。③上樣:取15 μL蛋白樣品上樣,12% SDS-PAGE電泳,電極緩沖液為T(mén)ris-甘氨酸電泳緩沖液。按次序上樣,一定安排已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物。④電泳。⑤取下凝膠,考馬斯亮藍(lán)或銀染色染色觀察分析。

    1.2.2 酶解及iTRAQ標(biāo)記 (1)樣品處理:每組取120 μg樣品于30 μL SDT溶液,沸水浴5 min,冷卻至室溫。加入200 μL UA溶液混勻,轉(zhuǎn)入30 kd超濾離心管,離心14000 g 15 min。加入200 μL UA溶液,離心14000 g 15 min,棄濾液。加入100 μL IAA,600 rpm振蕩1 min,避光室溫30 min,離心14000 g 10 min。加入100 μL UA溶液,離心14000 g 10 min重復(fù)2次。加入100 μL 25 mM NH4HCO3,離心14000 g 10 min重復(fù)2次。加入40 μL Trypsin buffer 600 rpm振蕩1 min,37℃ 16~18 h。換新收集管,離心14000 g 10 min,收集濾液。(2)蛋白質(zhì)含量測(cè)定:同1.2.1。(3)同位素標(biāo)記:從每組取等量肽段(約100 μg),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記。

    1.2.3 肽段的分離及鑒定 分別進(jìn)行強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析分級(jí)分離、毛細(xì)管高效液相色譜分離、ESI質(zhì)譜鑒定。

    1.3 數(shù)據(jù)分析及處理

    (1)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析:原始文件用iTRAQ Result Multiple File Distiller分析定量數(shù)據(jù),并用Sequest軟件鑒定多肽分子。定量方法采用Identified iTRAQ Statistic Builder軟件分析,依據(jù)同位素報(bào)告基因的相對(duì)含量進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。(2)生物信息學(xué)分析:分析差異蛋白在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)中的分布狀況,利用Cluster軟件進(jìn)行蛋白功能注釋?zhuān)贙EGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白基因進(jìn)行通路注釋?zhuān)玫讲町惖鞍谆蛩鶇⑴c的所有的通路,利用Fisher精確檢驗(yàn)計(jì)算每個(gè)通路的顯著性水平,并對(duì)多重假設(shè)檢驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行校正并獲得誤判率,從而篩選出差異基因參與的顯著通路[3]。

    2 結(jié)果

    2.1 絕經(jīng)前后的TNBC患者差異蛋白顯著性功能分析

    絕經(jīng)前在已鑒定的差異量2倍以上的214種蛋白中,具有Go注釋的有89種,其中12種蛋白參與小分子代謝,10種蛋白參與細(xì)胞粘附,7種參與炎癥反應(yīng),7種參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)。見(jiàn)封三圖1。絕經(jīng)后已鑒定的差異量2倍以上的360種蛋白中,具有Go注釋的有156種,其中24種蛋白參與小分子代謝,12種蛋白參與細(xì)胞粘附,8種參與炎癥反應(yīng),15種參與調(diào)節(jié)基因表達(dá),12種具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,3種參與凋亡反應(yīng),17種發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)功能,20種參與血液凝固,2種參與細(xì)胞內(nèi)蛋白代謝過(guò)程,見(jiàn)封三圖2。將絕經(jīng)前和絕經(jīng)后顯著差異蛋白整理繪制相互作用圖譜,發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前差異蛋白相互作用組較集中,而絕經(jīng)后的差異蛋白較多,且分布較散。見(jiàn)封三圖3、4。

    2.2 絕經(jīng)前后的TNBC患者差異蛋白Pathway分析

    基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway注釋?zhuān)玫讲町惢蛩鶇⑴c的所有途徑。絕經(jīng)前有ECM-受體相互作用、蛋白質(zhì)消化吸收、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、互補(bǔ)及凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)和聚集粘附這5種途徑為差異基因顯著參與的途徑。絕經(jīng)后具有15種特異的Pathway,差異蛋白參與的途徑包括粘著斑、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)加工、丙酮酸的新陳代謝、PPAR信號(hào)通路、谷胱甘肽新陳代謝、葡萄球菌感染、核糖體、糖酵解、糖異生、補(bǔ)體、苯丙氨酸代謝、吞噬作用等。

    2.3 絕經(jīng)前后的TNBC患者差異蛋白驗(yàn)證分析

    采用iTRAQ技術(shù)不僅可發(fā)現(xiàn)胞漿蛋白,還有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白,并可檢測(cè)出低豐度蛋白、強(qiáng)堿性蛋白、小于10 kD或大于200 kD的蛋白。結(jié)果顯示,在絕經(jīng)前后兩組共鑒定1254種蛋白質(zhì),其中1243種有定量信息。選擇表達(dá)量差異2倍以上的作為顯著差異蛋白,與乳腺癌旁組織相比,絕經(jīng)前(premenopause)共有214種顯著差異蛋白,絕經(jīng)后(Hpost-menopauseH)共有360種顯著差異蛋白(表2)。

    表2 絕經(jīng)前后TNBC患者顯著差異蛋白(與乳腺癌旁組織相比)(個(gè))

    3 討論

    三陰性乳腺癌其發(fā)病及致病機(jī)制比較復(fù)雜,激素環(huán)境一直被認(rèn)為是TNBC致病潛在重要的影響因子之一[7]。經(jīng)期是激素變化的顯著階段,絕經(jīng)前與絕經(jīng)后體內(nèi)激素發(fā)生很大的變化,其中雌激素越多,絕經(jīng)女性患某些乳腺癌的幾率相對(duì)越大[4]。目前,尚無(wú)絕經(jīng)與TNBC關(guān)系的研究報(bào)道,是否絕經(jīng)對(duì)三陰性乳腺癌發(fā)生具有影響,絕經(jīng)前后不同激素水平條件下三陰性乳腺癌發(fā)生的機(jī)制是否存在差異,至今未知。

    三陰性乳腺癌的治療目前還沒(méi)有一個(gè)明確的、行之有效的靶向治療單劑,其中分子靶向治療是目前治療癌癥的有效手段,且TNBC的治療靶點(diǎn)的篩查工作已取得了一定的研究進(jìn)展,其中差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法被認(rèn)為目前篩選臨床治療靶點(diǎn)最為有效的研究方法之一[5]。差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法主要包括雙向凝膠電泳、雙向熒光差異凝膠電泳、高效液相色譜技術(shù)、應(yīng)用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)等分離技術(shù)及質(zhì)譜鑒定技術(shù)。由于凝膠電泳仍具有低靈敏度、無(wú)法檢測(cè)低豐度蛋白的局限,因此近期人們比較關(guān)注同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)的應(yīng)用[6-8]。與凝膠為基礎(chǔ)的定量方法比較,iTRAQ技術(shù)可捕獲全蛋白、且無(wú)需凝膠電泳、同時(shí)可進(jìn)行多樣品分析,從而成為研究三陰性乳腺癌靶向位點(diǎn)的有力手段之一[9,10]。然而iTRAQ技術(shù)應(yīng)用到三陰性乳腺癌機(jī)制研究及靶向位點(diǎn)的探索至今仍較少。iTRAQ技術(shù)是采用4種或8種同位素的標(biāo)簽,通過(guò)特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán),進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,可同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量或絕對(duì)含量。Leroi D等[11]采用iTRAQ技術(shù)探討子宮內(nèi)膜癌的差異蛋白,并發(fā)現(xiàn)chaperonin 10,pyruvate kinase M1 or M2 isozyme,calgizzarin等9種蛋白可以作為潛在的靶向治療位點(diǎn)。

    本研究應(yīng)用iTRAQ技術(shù)結(jié)合2D LC-MS/MS,在絕經(jīng)前和絕經(jīng)后兩組中共鑒定1254種蛋白質(zhì),其中1243種有定量信息。選擇表達(dá)量差異2倍以上的作為顯著差異蛋白,與癌旁組織相比,絕經(jīng)前共有214種顯著差異蛋白,絕經(jīng)后共有360種顯著差異蛋白。其中與癌旁組織相比,絕經(jīng)前的三陰性乳腺癌組織中上調(diào)蛋白81種,下調(diào)蛋白133種,絕經(jīng)后上調(diào)蛋白157種類(lèi),下調(diào)203種,絕經(jīng)前后差異蛋白表達(dá)并不完全一致,說(shuō)明絕經(jīng)前后TNBC患者的蛋白表達(dá)情況具有一定的差異性及特殊性。在這些差異表達(dá)的蛋白中,有一些功能尚不十分清楚,而有一些與腫瘤密切相關(guān)。且本研究將絕經(jīng)前和絕經(jīng)后顯著差異蛋白整理繪制相互作用圖譜(封三圖3、4),結(jié)果顯示,絕經(jīng)前差異蛋白相互作用組較集中,而絕經(jīng)后的差異蛋白較多,且分布較散。同時(shí)我們對(duì)絕經(jīng)前后的TNBC患者差異蛋白的通路分析顯示:絕經(jīng)前癌組織的差異蛋白存在于5種差異顯著途徑中;絕經(jīng)后癌組織的差異蛋白存在于15種差異顯著途徑中。絕經(jīng)前后的TNBC患者共同存在的差異蛋白主要體現(xiàn)在三條顯著途徑,分別為ECM-受體相互作用途經(jīng)、蛋白質(zhì)消化吸收、腎素-血管緊張素系統(tǒng),而絕經(jīng)后也有獨(dú)特的差異顯著通路,推測(cè)以絕經(jīng)為界限,絕經(jīng)前和絕經(jīng)后的TNBC具有不同的致病機(jī)制[12]。共同的通路是三陰性乳腺癌的共性致病調(diào)控途徑,而絕經(jīng)后仍存在12種調(diào)控途徑,包括粘著斑、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)加工、丙酮酸的新陳代謝、PPAR信號(hào)通路、谷胱甘肽新陳代謝、葡萄球菌感染、核糖體、糖酵解、糖異生、補(bǔ)體、苯丙氨酸代謝、吞噬作用等相關(guān)蛋白,具有一定特性,因此根據(jù)絕經(jīng)前后致病機(jī)制的不同,可以選擇不同的治療方案,為針對(duì)性治療三陰性乳腺癌指明方向。

    總之,本研究中我們應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對(duì)絕經(jīng)前后三陰性乳腺癌及癌旁正常組織的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較分析,確定了差異表達(dá)的蛋白,并對(duì)這些蛋白進(jìn)行了功能分析,確定了這些差異蛋白顯著參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,但這些差異蛋白在絕經(jīng)前后三陰性乳腺癌具體通過(guò)什么機(jī)制、如何發(fā)揮作用還需要繼續(xù)進(jìn)行大樣本進(jìn)一步深入地研究。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] 沈鎮(zhèn)宙,邵志敏. 乳腺腫瘤學(xué)[M]. 上海:上??萍汲霭嫔纾?005:1-2.

    [2] Perou CM,Sodie T,Eisen MB,et al. Molecular portraits of human breast tumours. [J]. Nature,2000,406:747-752.

    [3] Rouzier R, Perou C M, Symmans W V, et al. Breast cancer molecular subtypes respond differently to preoperative chemotherapy[J]. Clin Cancer Res,2005,11(16):5678-5685.

    [4] Garey LA,Perou CM,Livasy CA,et al. Race,breast cancer subtypes,and survival in the Carolina Breast Cancer Study[J]. JAMA,2006,295(21):2492-2502.

    [5] Dent R,Trudeau M,Prichard KI,et al. Triple-negative breast cancer:Clinical features and patterns of recurrence[J].Clinical Cancer Research,2007,13(15):4429-4434.

    [6] Dent R,Hanna WM,Trudeau M,et al. Pattern of metastasis spread in triple-negative breast cancer[J]. Breast Cancer Res Treat,2009,115:423-428.

    [7] Bauer KR,Brown M,Cress R D,et al. Descriptive analysis of estrogen receptor(ER)-negative,progesterone receptor(PR)-negative,and HER2-negative invasive breast cancer,the so-called triple-negative phenotype:A popμl ation-based study from the California Cancer Registry[J]. Cancer,2007,109(9):1721-1728.

    [8] Milikan RC,Newman B,Tse CK,et al. Epidemiology of basal-like breast cancer[J]. Breast Cancer Res Treat,2008, 109:123-139.

    [9] Freedman GM,Anderson PR,Li T,et al. Locoregional recurrence of triple-negative breast cancer after breast-conserving surgery and radiation[J]. Cancer, 2009,115(5):946-953.

    [10] 楊德宏,劉紅,趙晶. 三陰型乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后分析[J]. 中國(guó)腫瘤臨床,2008,35(9):501-504.

    [11] Leroi De Souza, Georg Diehl, Mary Joe Rodrigues, et al. Search for cancer markers from endometrial tissues using differentially labeled tags iTRAQ and cICAT with multidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry[J]. Journal of Proteome Research,2005,4(2):377-386.

    [12] Charles F,Streckfus, Otilia Mayorga-Wark, et al. Breast cancer related proteins are present in saliva and are modulated secondary to ductal carcinoma in situ of the breast[J]. Cancer Investigation,2008,26(2):159-167.

    (收稿日期:2014-10-30)

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