生物轉(zhuǎn)化食用菌菌糠木質(zhì)纖維素產(chǎn)燃料乙醇的研究進展*

虞志強，余水靜，李昆太

1(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌，330045)

2(江西理工大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，江西贛州，341000)

當(dāng)前，世界各國對石油的需求量劇增，而石油作為一種不可再生資源，其供應(yīng)日趨緊張，這使得開發(fā)可持續(xù)利用的替代性能源迫在眉睫。生物質(zhì)發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料乙醇是目前極具潛在發(fā)展前景的技術(shù)之一，已日益引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注［1-2］。目前，生物乙醇生產(chǎn)原料大多是可供食用的糖和淀粉類物質(zhì)，如甘蔗、木薯、馬鈴薯、甜高粱等［3-6］，存在著與人爭糧的潛在風(fēng)險。因此，如何利用廢棄的植物纖維類物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，成為了當(dāng)前的研究熱點。

食用菌栽培所用的原料與生物乙醇生產(chǎn)所用的植物纖維類原料大體相同，其主要組分為木質(zhì)纖維素。許多食用菌為木腐菌類型的白腐真菌，其具備酶解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等的能力。因此，利用食用菌栽培過程作為生物乙醇制備的微生物預(yù)處理過程，開展木腐型食用菌菌糠轉(zhuǎn)化乙醇的研究，不但能有效解決廢棄物菌糠的處理問題，而且也能提高生物乙醇產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。

1 食用菌菌糠的基質(zhì)特點及其在生物轉(zhuǎn)化乙醇中的應(yīng)用潛力分析

1.1 食用菌菌糠的基質(zhì)特點

食用菌菌糠(SMS)又稱為蘑菇渣、菇渣和菌渣等，是以棉籽殼、稻草、鋸木屑、甘蔗渣、玉米芯、農(nóng)作物秸稈以及工業(yè)廢物(如醋糟、酒糟、制藥廠黃漿液及造紙廠廢液等)為主要原料栽培食用菌后的固體廢棄培養(yǎng)基。

食用菌菌糠中的營養(yǎng)物質(zhì)成分受多種因素的影響，例如栽培的菌種不同、栽培原料的組分不同、培養(yǎng)環(huán)境的條件等［7］。盡管食用菌菌糠組成成分差異很大，其基本成分主要包括:秸稈、木屑、干草、玉米芯等高木質(zhì)纖維性物料，米糠、麥麩、畜禽糞便、尿素等養(yǎng)分調(diào)理性物料，以及石灰粉、石膏粉等pH調(diào)理性物料。此外，食用菌栽培過程中大量生長的菌絲體使菌糠中還含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖以及多種微量元素和活性物質(zhì)［8］。

1.2 食用菌菌糠在生物轉(zhuǎn)化乙醇中的應(yīng)用潛力分析

隨著各國食用菌產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，食用菌子實體采收后產(chǎn)生了大量的菌糠。2012年全國食用菌總產(chǎn)量為2 827.99萬 t［9］，這意味著2012年全國菌糠產(chǎn)量不少于2 000萬t。但是目前只有少量食用菌菌糠被有效利用，絕大部分被作為廢物直接棄置在自然界中［10-11］。這不僅造成了資源的浪費，而且還存在環(huán)境污染問題。

在食用菌栽培過程中，通過食用菌菌體的生物固氮作用、酶解作用等一系列生物轉(zhuǎn)化過程，原料中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量均比發(fā)酵前提高2倍以上，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等均已被不同程度地降解，其中粗纖維素降低50%以上，木質(zhì)素降低30%以上，棉酚降低60%以上，同時還產(chǎn)生了多種糖類、有機酸類和生物活性物質(zhì)［12］。另外，食用菌子實體采摘后，菌糠中殘留有許多纖維素胞外水解酶［13］。例如，漆酶普遍存在于雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)、鳳尾菇(Pleurotussajor-caju)、側(cè)耳(P.ostreatus)、香菇(Lentinula edodes)、金針菇(Flammulina velutipes)和猴頭菇(Hericium erinaceus)的菌糠中［14-16］。有研究表明，香菇菌糠中含有較高的α-淀粉酶(229 nkat/g)、纖維素酶(759 nkat/g)和β-葡萄糖苷酶(767 nkat/g)，金針菇菌糠中含有較高的木聚糖酶(119 nkat/g)［15］。鳳尾菇菌糠中木質(zhì)素過氧化物酶的含量最高，分別為β-葡萄糖苷酶、漆酶、木聚糖酶和纖維素酶的2倍、22倍、30 倍和86 倍［14］。

由此可見，基于食用菌菌糠主要含有的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、抗營養(yǎng)因子和蛋白質(zhì)(胞外纖維素降解酶類)等組分，其具備作為生物乙醇轉(zhuǎn)化基質(zhì)的潛力。例如有研究表明［17］，側(cè)耳菌糠經(jīng)過預(yù)處理和水解后，有＞98%的葡聚糖和75%的木聚糖被轉(zhuǎn)化，可作為生物乙醇生產(chǎn)非常理想的潛在原料;香菇菌糠經(jīng)過蒸汽爆破預(yù)處理、酶水解糖化和酵母發(fā)酵，獲得乙醇的理論產(chǎn)量可達87.6%，即100 g香菇菌糠轉(zhuǎn)化可獲得 15.9 g 乙醇［18］。Cara等［19］研究表明，油橄欖樹修剪枝經(jīng)過蒸汽爆破預(yù)處理、酶糖化和酵母發(fā)酵，乙醇的轉(zhuǎn)化率為64%。Sassner等［20］研究表明硫酸浸漬后的柳樹經(jīng)過蒸汽爆破預(yù)處理、酶糖化和酵母發(fā)酵，乙醇的轉(zhuǎn)化率為79%。Asada等［21］研究表明，一次性白楊筷子經(jīng)過蒸汽爆破預(yù)處理、酶糖化和酵母發(fā)酵，乙醇的轉(zhuǎn)化率為79%。可見，食用菌菌糠木質(zhì)纖維素在生物轉(zhuǎn)化乙醇的應(yīng)用上有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2 目前利用食用菌菌糠生物轉(zhuǎn)化乙醇的常用工藝及其特點

由于食用菌菌糠含有的成分以木質(zhì)纖維素為主，其生物轉(zhuǎn)化乙醇的工藝和木質(zhì)纖維素產(chǎn)乙醇的發(fā)酵工藝基本相同。從木質(zhì)纖維到乙醇的生物轉(zhuǎn)化過程主要包括木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理，纖維素和半纖維素的酶解糖化和發(fā)酵，最后乙醇產(chǎn)品的回收純化［22-23］。有意思的是，甚至有些木腐型食用菌可以直接將菌糠中纖維素降解轉(zhuǎn)化生成乙醇。

2.1 食用菌菌糠(木質(zhì)纖維原料)預(yù)處理工藝

木質(zhì)纖維素原料是高度頑固且難以轉(zhuǎn)換成可以被微生物發(fā)酵成生物燃料的單糖［24］的一類營養(yǎng)物質(zhì)。木質(zhì)纖維原料預(yù)處理是生物乙醇轉(zhuǎn)化的第一步和最為關(guān)鍵的一步，同時也是耗費成本的一步［25-26］。預(yù)處理的主要目的是通過破壞木質(zhì)素和半纖維素，來降低纖維素的結(jié)晶性，增加其多孔性，這樣才能使酶制劑與纖維素充分接觸，完成酶促反應(yīng)［27］。目前較為常用的食用菌菌糠預(yù)處理方法有物理預(yù)處理、化學(xué)預(yù)處理和微生物降解三大類［28］。其中，水熱預(yù)處理技術(shù)由于具有不需(或較少)添加化學(xué)品、較少產(chǎn)生發(fā)酵抑制物和污染物等優(yōu)點，近年來廣受國內(nèi)外研究者的重視［29］。而微生物降解法具有能耗低、條件溫和等優(yōu)點［30］，不過周期太長，而且微生物分解木質(zhì)素的同時也能產(chǎn)生纖維素和半纖維素酶，影響得糖率，有待于通過基因工程或代謝工程選育選擇性更強的分解木質(zhì)素的微生物［31］。

自然界中參與降解木質(zhì)素的微生物種類主要真菌、放線菌和細菌等，而真菌是最重要的一類。值得注意的是，許多木腐型食用菌能夠選擇性高效降解植物纖維原料中的木質(zhì)素［32-33］，可作為纖維素轉(zhuǎn)化生物乙醇的預(yù)處理微生物菌種。例如，鳳尾菇接種在固態(tài)洋麻桿培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)25～30 d后，木質(zhì)素去除率可高達50.20%，有助于提高后續(xù)的洋麻纖維素酶水解效率［34］。另外有研究發(fā)現(xiàn)，食用菌側(cè)耳的過氧化物酶基因失活會降低對木質(zhì)素的降解能力［35］。

2.2 纖維素和半纖維素的酶解糖化和發(fā)酵工藝

纖維素的酶解糖化是一個復(fù)雜的過程，受到多種因素的影響。對預(yù)處理后的菌糠進行纖維素酶和木聚糖酶的水解，通過進行系統(tǒng)研究和工藝優(yōu)化，達到菌糠的木質(zhì)纖維素的最佳水解效果。近年來，研究者們［36］針對木質(zhì)纖維素降解機制的當(dāng)前理解，正試圖往生產(chǎn)纖維素酶解糖化和木質(zhì)纖維素的水解工藝伏化，以及產(chǎn)生纖維素酶的高效真菌菌株等方面進行努力。

利用微生物發(fā)酵木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵工藝大致可以分為纖維素直接發(fā)酵、間接發(fā)酵、固定化細胞發(fā)酵、混合菌種發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵(SSF)等［27］。同步糖化發(fā)酵的優(yōu)點是酶解的產(chǎn)物葡萄糖可以立刻被酵母發(fā)酵生成乙醇，解除了葡萄糖對纖維素酶的反饋抑制，從而有利于纖維素酶水解反應(yīng)順利地進行，有效地提高了糖化和發(fā)酵的效率，但不足之處是糖化和發(fā)酵最適溫度不同［37-38］。半同步糖化發(fā)酵(SSSF)包括了預(yù)糖化和SSF兩個階段，結(jié)合了間接發(fā)酵和SSF的優(yōu)點，并可以在一定程度上彌補最適溫度不同造成的反應(yīng)不充分。有研究表明［39］，在SSSF工藝下的乙醇生產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率明顯高于同步糖化發(fā)酵。

2.3 食用菌直接降解菌糠轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇

研究發(fā)現(xiàn)，有些木腐型食用菌可以直接將纖維素降解轉(zhuǎn)化生成乙醇，如白腐菌金針菇能將D-葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖高效率地發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇(理論回收率達到88%)，表明金針菇具有聯(lián)合生物加工(consolidated bioprocessing)的有利特征［40］。通過金針菇全基因組測序與分析發(fā)現(xiàn)，金針菇含有木質(zhì)素降解的69個真菌氧化木質(zhì)素酶(FOLymes)、碳水化合物降解的392個碳水化合物活性酶(CAZymes)。此外，金針菇菌絲體內(nèi)含有高度表達的58個醇脫氫酶基因(alcohol dehydrogenase genes)［41］，這進一步從分子水平證實了金針菇具有聯(lián)合生物加工特征，可將纖維素降解轉(zhuǎn)化生成乙醇。

2.4 新型生物技術(shù)在食用菌菌糠生物轉(zhuǎn)化乙醇中的應(yīng)用

快速生物轉(zhuǎn)化與集成技術(shù)回收工藝(RaBIT)［42］是一種利用在纖維素生物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化第二代燃料乙醇的新型生物技術(shù)。RaBIT能有效降低生物處理時間和生物催化劑成本，具有雙重的優(yōu)點。木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)通過RaBIL進行生物轉(zhuǎn)化，不僅能有效減少總的生物加工時間(酶解和發(fā)酵)，提高生物燃料生產(chǎn)效率，而且回收的生物催化劑(酶和微生物)可以進行下一個周期，有效節(jié)省生物催化劑成本。2012年Jin M等人［43］報道，據(jù)初步經(jīng)濟分析表明，RaBIT過程的五步再循環(huán)過程中節(jié)約了62%水解和發(fā)酵相關(guān)的投入成本及離心和過濾成本，并減少了38%酶的成本。由此可見，RaBIT工藝在食用菌菌糖生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇中具有良好的應(yīng)用前景。

3 食用菌菌糠生物轉(zhuǎn)化乙醇所存在的主要問題及其應(yīng)用前景

3.1 食用菌菌糠生物轉(zhuǎn)化乙醇所存在的主要問題

3.1.1 預(yù)處理工藝方面

高效率的預(yù)處理工藝是食用菌菌糠的降解轉(zhuǎn)化乙醇的核心關(guān)鍵技術(shù)之一。研究表明［44］，稀酸、汽爆、水熱、氨法等多種預(yù)處理技術(shù)都能使纖維素和半纖維素的水解轉(zhuǎn)化率達到80%以上。高效水解轉(zhuǎn)化率、較少產(chǎn)生發(fā)酵抑制物和污染物這將需要新的生物技術(shù)來解決提高效率的。食用菌栽培過程中對食用菌菌糠有效預(yù)處理將是未來對食用菌菌糠木質(zhì)纖維素有效利用的一個關(guān)鍵技術(shù)。

3.1.2 纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)方面

纖維素酶研究近年來不斷有新的技術(shù)突破，特別是通過添加少量酶解協(xié)同因子，可使纖維素酶的酶解效率顯著提高，酶用量和噸乙醇用酶成本顯著降低。繼續(xù)進行纖維素酶生產(chǎn)菌株的改造、提高纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)水平，以及建立纖維素酶的就地生產(chǎn)方式來減少酶制劑加工成本，仍是今后長時間內(nèi)需要努力的方向［29］。

3.1.3 乙醇發(fā)酵菌種方面

由于具有優(yōu)良的發(fā)酵能力和更好的耐受性，釀酒酵母是優(yōu)選的工業(yè)微生物乙醇生產(chǎn)菌種。然而，啤酒酵母不能利用戊糖從木質(zhì)纖維素材料的半纖維素釋放，因而降低產(chǎn)乙醇的產(chǎn)率。另外，雖然釀酒酵母是健壯的，但它不能充分地抵抗從木質(zhì)纖維素預(yù)處理的過程產(chǎn)生的抑制劑［45］。近年來，通過對菌株進行基因工程改造，已實現(xiàn)木糖-葡萄糖共發(fā)酵，木糖糖醇轉(zhuǎn)化率已經(jīng)接近葡萄糖，發(fā)酵醪液中乙醇濃度已基本滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。但是，對高強度預(yù)處理后物料中的發(fā)酵抑制物具有抗性，并能直接高效地共發(fā)酵多種非發(fā)酵性糖類的菌株目前尚未經(jīng)過工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用驗證［29］。發(fā)酵菌株的發(fā)酵抑制物耐受性和多糖共發(fā)酵速率仍是重要的限制因素和研究重點。

3.2 食用菌菌糠生物轉(zhuǎn)化乙醇應(yīng)用前景

食用菌菌糠基質(zhì)大多為植物纖維類物質(zhì)，加之許多種木腐型食用菌本身就具備降解植物纖維的能力，因此利用食用菌菌糠開展生物轉(zhuǎn)化第二代燃料乙醇的研究將具有廣泛的開發(fā)和應(yīng)用前景。尋求高效栽培預(yù)處理技術(shù)、高效的發(fā)酵工藝和乙醇生產(chǎn)菌種，一方面可降低木質(zhì)纖維素預(yù)處理的成本，另一方面可有效解決廢棄物菌糠的處理問題。利用食用菌菌糠中木質(zhì)纖維類物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化第二代燃料乙醇符合當(dāng)前“不與人爭糧、不與糧爭地”原則，對解決目前的能源問題具有重要的現(xiàn)實意義。

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