補腎丸定性定量方法研究

張愛 項菲

（麻陽縣食品藥品監(jiān)督管理局，湖南 麻陽 419400）

補腎丸定性定量方法研究

張愛 項菲

（麻陽縣食品藥品監(jiān)督管理局，湖南 麻陽 419400）

目的：建立補腎丸的定性定量標準。方法：用薄層色譜法（TLC）對鎖陽、白芍及黃柏進行定性鑒別；用高效液相色譜法（HPLC）測定補腎丸中熟地黃的含量，采用Dikma Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%醋酸溶液（16∶84）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：334 nm；進樣量：20 μL。結果：TLC能明顯檢出鎖陽、白芍及黃柏特征斑點，無陰性藥材干擾。毛蕊花糖苷進樣量在5.08～81.28 μg范圍內線性關系良好，r=0.999 44，平均回收率為98.72%，RSD=0.82%。結論：定性、定量方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，能有效控制補腎丸的內在質量。

補腎丸；質量標準；薄層色譜法；高效液相色譜法；毛蕊花糖苷

補腎丸是由鎖陽、枸杞子、白芍、五味子及熟地黃等10味中藥制成的復方制劑，具有鎖陽固精，滋陰補腎的功效，廣泛應用于腎水不足，陰虛陽亢，頭暈咳嗽，腰膝酸痛，夢遺滑精等病癥。熟地黃為方中君藥，其有效成分為毛蕊花糖苷。其質量標準收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》（第二冊），只有顯微鑒別，為了保證該藥品質量的穩(wěn)定有效，本研究參考資料文獻，對制劑中的鎖陽、白芍及黃柏進行定性鑒別，同時用高效液相色譜法（HPLC）對制劑中熟地黃中所含的毛蕊花糖苷進行含量測定。建立了方法可靠、準確，專屬性強的質量控制方法，提升了該制劑質量標準。

1 儀器與試藥

美國安捷倫 1260高效液相色譜儀（Agilent 1260四元泵，Agilent自動進樣器，Agilent數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)）；CBL9960A超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；日本島津AUW220D電子分析天平（十萬分之一）；毛蕊花糖苷（批號：111530-200706）、熊果酸（批號：110742-200516）、芍藥苷（批號：110736-201337）、黃柏對照藥材（批號：121510-200703）、鹽酸黃柏堿（批號：111895-201202），均購自中國食品藥品檢定研究院；補腎丸（呼倫貝爾松鹿制藥有限公司，6 g/丸，批號：130708，131119，140322，140603）；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

2 薄層定性鑒別

2.1 鎖陽

取本品6 g，剪碎，加等量硅藻土，研勻，加乙醇 60 mL，超聲處理 30 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取缺鎖陽的陰性樣品，同法制備成陰性對照溶液。再取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄 ⅥB）試驗，吸取供試品溶液10 μL，對照品溶液4 μL及陰性對照溶液10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）為展開劑，展開13 cm取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點。陰性對照無干擾（圖1）。

2.2 白芍

圖1 鎖陽TLC圖

取本品 10 g，剪碎，加等量硅藻土，研勻，加乙醇 60 mL，超聲處理 30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，置水浴上濃縮至1 mL，加適量中性氧化鋁，拌勻，干燥，加在中性氧化鋁柱（100目，4 g，內徑為1 cm），用甲醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺白芍的陰性樣品，同法制備成陰性對照溶液。再取芍藥苷對照品，加乙醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（TLC）（《中華人民共和國藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述 3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在100℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照無干擾（圖2）。

圖2 白芍TLC圖

2.3 黃柏

取本品6 g，剪碎，加等量硅藻土，研勻，加1%醋酸甲醇溶液50 mL，于60℃超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取缺黃柏的陰性樣品，同法制備成陰性對照溶液。再取黃柏對照藥材0.2 g，加1%醋酸甲醇20 mL，同法制成對照藥材溶液。再取鹽酸黃柏堿對照品，加甲醇制成每1 mL含 0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC（《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述4種溶液各3～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶15∶4）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照無干擾（圖3）。

圖3 黃柏TLC圖

3 熟地黃的含量測定

3.1 供試品溶液的制備

取裝量差異項下的本品，剪碎，混勻，取約3 g，精密稱定，加入硅藻土3 g，研勻，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質量，加熱回流30 min（功率250 W，頻率50 kHz），取出，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液50 mL，減壓回收溶劑至干，殘渣用流動相溶解，轉移至10 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2 陰性樣品溶液的制備

取除去熟地黃以外的其他藥材，按供試品制備方法“3.1”項下方法制成陰性溶液。

3.3 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的毛蕊花糖苷對照品10.16 mg，置100 mL量瓶中，加入甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液（濃度為101.6 μg/mL）；精密量取上述溶液5 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得（濃度為10.16 μg/mL）。

3.4 色譜條件

Dikma Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動相：乙腈-0.1%醋酸溶液（16∶84）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：334 nm；進樣量：20 μL。 理論板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計算應不低于3 000。

3.5 專屬性試驗

照“3.4”項下色譜條件，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，在毛蕊花糖苷對照品色譜相應的位置上，供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰，陰性液在此峰位無吸收，對本品中毛蕊花糖苷含量測定無干擾。見圖4。

圖4 補腎丸HPLC圖

3.6 線性范圍考察

精密吸取 “3.3”項下濃度為101.6 μg/mL的對照品儲備溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL至 10 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，按“3.1”項下方法進行測定，以進樣量為橫坐標X，色譜峰面積為縱坐標Y，計算回歸方程，毛蕊花糖苷回歸方程為：

Y=3 095.5X－2 799.1。

r=0.999 44，毛蕊花糖苷進樣量在5.08～ 81.28 μg/mL范圍內線性關系良好。

3.7 精密度試驗

精密吸取供試品（批號：140603）溶液10 μL，注入液相色譜儀中，在上述色譜條件下測定，連續(xù)進樣6次，分別測定各次峰面積，毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.76%。結果表明該色譜系統(tǒng)具有較好的精密度。

3.8 穩(wěn)定性試驗

取供試品（批號：140603）溶液，分別在 0，4， 6，8，12，24 h，按上述色譜條件進樣10 μL，測定色譜峰面積，結果毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.91%。表明樣品溶液在所考察時間內穩(wěn)定性良好。

3.9 重現(xiàn)性試驗

取同一批供試品（批號：140603），精密稱取6份，按供試品測定項下方法操作，重復測定6次，毛蕊花糖苷平均含量為 0.331 0 mg/丸，RSD為 0.75%。表明該方法重現(xiàn)性好。

3.10 加樣回收率試驗

取已知毛蕊花糖苷含量（批號：140603，毛蕊花糖苷含量0.331 0 mg/丸）的供試品約1.5 g共 9份，分別精密加入濃度為101.6 μg/mL毛蕊花糖苷對照品溶液 0.8，0.8，0.8，1.0，1.0，1.0，1.2，1.2， 1.2 mL，按供試品溶液制備方法操作，測定加標樣品中的毛蕊花糖苷含量，計算回收率，結果見表1。

3.11 樣品含量測定

取不同批號的樣品，按供試品測定項下方法操作，測定毛蕊花糖苷含量，結果見表2。

4 討論

4.1 經(jīng)過不斷摸索試驗，制定了鎖陽、白芍及黃柏的鑒別方法，該方法特征斑點明顯，色譜分離清晰，可作為補腎丸中鎖陽、白芍及黃柏的專屬性鑒別。

表1 回收試驗結果（n＝9）

表2 樣品含量測定結果

4.2 本試驗樣品處理方法簡單，測定結果準確可靠，可有效控制本制劑的質量，對保證制劑質量有著重要意義。

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Study on the Methods for Qualitative and Quantitative Control of Bushen Pills

Zhang Ai，Xiang Fei（Food and Drug Administration Bureau of Mayang County，Hunan Mayang 419400,China）

Objective:To establish the standards for qualitative and quantitative control of Bushen pills.Methods:TLC was used to identify quantitatively Cynomorium songaricum Rupr,Paeoniae radix alba and Phellodendri chinensis cortex.The content of Radix Rehmanniae Praeparata in Bushen pills was determined by HPLC.Dikma Diamonsil column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）was adopted with a mobile phase of acetonitrile-0.1%acetic acid（16∶84）at a flow rate of 1.0 mL/min,the column temperature was at 35℃,the detection wavelength was at 334 nm and the sample size was 20 μL.Results:The feature spots of Cynomorium songaricum Rupr,Paeoniae radix alba and Phellodendri chinensis cortex can be detected by TLC without interference of negative materials.A good linear relationship of acteoside was obtained within the range of 5.08～81.28 μg（r=0.999 44）.The average recovery was 98.72%with RSD of 0.82% （n=6）.Conclusion:The method is simple，accurate and reproducible and can be used for the effective control of the internal quality of Bushen pills.

Bushen Pills；Quality Standards；TLC；HPLC；Acteoside

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.08.004

2015-04-22）

張愛，女，主管藥師。研究方向：藥物分析。E-mail:569997073@qq.com

項菲，女，主管藥師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：1115844935@qq.com