不同處理方法對(duì)賀蘭山紫蘑菇多糖抗氧化活性的影響

劉繼婷，魯曉麗，張自萍*

（寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021）

不同處理方法對(duì)賀蘭山紫蘑菇多糖抗氧化活性的影響

劉繼婷，魯曉麗，張自萍*

（寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021）

采用熱水浸提法提取賀蘭山紫蘑菇多糖，分別考察真空冷凍干燥法、真空干燥法（丙酮乙醚洗滌、乙醇洗滌）對(duì)其抗氧化活性的影響，確定最優(yōu)干燥方法；干燥后多糖再分別經(jīng)Sevag法脫蛋白、大孔樹脂脫色、雙氧水脫色3種方法進(jìn)一步處理，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法分析不同處理方法對(duì)其抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，真空干燥法（乙醇洗滌）對(duì)賀蘭山紫蘑菇多糖的抗氧化活性影響最?。淮罂讟渲撋Ч麅?yōu)于雙氧水脫色，Sevag法對(duì)該多糖抗氧化活性影響較大，應(yīng)盡量避免使用。

多糖提??；干燥；脫色；脫蛋白；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法；抗氧化

氧化還原反應(yīng)在機(jī)體中時(shí)刻發(fā)生，自由基在氧化反應(yīng)中起重要作用，自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為引起人類衰老的主要原因就是細(xì)胞代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生自由基[1]。正常機(jī)體中自由基氧化作用與抗氧化防御作用處于動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)自由基產(chǎn)生過(guò)多或抗氧化防御系統(tǒng)作用減弱時(shí)，體內(nèi)自由基極易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成新的自由基或氧化物，導(dǎo)致加速衰老。研究表明，自由基可導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，損害膜蛋白，降低細(xì)胞膜的滲透性[2-3]。多種疾病的發(fā)生都與自由基密切相關(guān)，如炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、糖尿病、癌癥、皮膚病、艾滋病等[4-6]。

食品中廣泛應(yīng)用的人工合成抗氧化劑如丁基羥基甲苯、叔丁對(duì)甲氧酚制劑、特丁基對(duì)苯二酚等具有明顯抗氧化作用，但由于這些物質(zhì)具有潛在毒性和致癌作用而受到人們的排斥[7]。因此，研究開發(fā)一種天然有效的抗氧化劑、保護(hù)人體不受自由基的破壞具有重要意義。

真菌多糖具有抗腫瘤[8]、抗氧化[9-10]、免疫調(diào)節(jié)[11-13]等多方面的生物活性。You Yuhong等[14]研究表明，靈芝多糖具有一定的抗衰老作用，其主要是通過(guò)提高體內(nèi)抗氧化酶的活性、清除體內(nèi)自由基來(lái)起到抗衰老的作用。多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)存在密切的關(guān)系。多糖提取工藝的不同對(duì)其結(jié)構(gòu)、活性有一定的影響，大分子多糖及糖蛋白復(fù)合物的提取方法按提取溶劑不同可以分為熱水浸提法、酸提法、堿提法、有機(jī)溶劑提取法、酶提取法等[15-16]。在提取多糖前，先用乙醇等有機(jī)溶劑處理原料，能除去原料中的脂類物質(zhì)，并使分解多糖的酶失活，防止直接提取時(shí)的多糖降解[17]。

影響多糖抗氧化活性的因素較多，如單糖組成、分子質(zhì)量大小、分枝結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象[18-21]，甚至是干燥方法[22-23]。真空干燥法適用于高溫條件下易被破壞的物質(zhì)，可以避免物質(zhì)與氧結(jié)合而被氧化。冷凍真空干燥是一種將物質(zhì)冷凍后真空脫水的過(guò)程，能產(chǎn)生高質(zhì)量的干燥品，但其干燥時(shí)間長(zhǎng)、能耗大。另外，脫蛋白、脫色過(guò)程都能影響多糖的抗氧化活性。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)不同處理工藝獲得賀蘭山紫蘑菇多糖對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力，確定合適的干燥、脫色、脫蛋白方法，提取有一定活性的賀蘭山紫蘑菇多糖，為賀蘭山紫蘑菇多糖的分離提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

賀蘭山紫蘑菇 銀川寧安堡土特產(chǎn)品有限公司；95%乙醇、無(wú)水乙醇（分析純） 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；濃硫酸（優(yōu)級(jí)純） 白銀西區(qū)銀環(huán)化學(xué)制劑廠；5%重蒸苯酚、氫氧化鈉、氯化鈉（分析純）天津市大茂化學(xué)制劑廠；36%雙氧水 天津市福晨化學(xué)制劑廠；D318大孔樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；定性濾紙（φ=9 cm） 杭州特種紙業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HJ-5磁力多功能電動(dòng)攪拌機(jī) 江蘇省金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GAMMA1-16LSC真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；玻璃真空干燥器 鹽城市雙豐玻璃儀器有限公司；U-5100可見分光光度計(jì)（配有Seya-Namioka單色儀、比例雙光束和閃爍氙燈） 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 賀蘭山紫蘑菇多糖的提取

取賀蘭山紫蘑菇200 g依次用95%乙醇、甲醇-氯仿（體積比1∶1）混合液按料液比1∶10（g/mL）浸泡脫脂48 h，脫脂后于50 ℃烘干粉碎，取干粉200 g，按料液比1∶10加入80%乙醇溶液2 L，于80 ℃回流處理2 次，每次2 h，過(guò)濾后晾干濾渣。取上述濾渣，以料液比1∶10加入蒸餾水2 L，于80 ℃提取2 次，每次提取2 h。合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以苯酚-硫酸法[24]檢測(cè)糖含量約20 mg/mL，邊攪拌邊緩慢加入95%乙醇，至乙醇終體積分?jǐn)?shù)達(dá)60%，靜置6 h，4 000 r/min離心得沉淀編號(hào)為P1，采用苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其蛋白含量[25]；離心上清液繼續(xù)加入95%乙醇，至乙醇的終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，靜置6 h，離心得沉淀編號(hào)為P2。

1.3.2 賀蘭山紫蘑菇多糖的處理

1.3.2.1 干燥

將80%醇沉的樣品P2平均分成3 份，第1份沉淀6 g依次用100 mL無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚充分?jǐn)嚢柘礈旌? 000 r/min離心，棄去上清液，沉淀置真空干燥器中干燥，編號(hào)為P3；第2份沉淀6 g用100 mL無(wú)水乙醇充分?jǐn)嚢柘礈旌? 000 r/min離心，棄去上清液，沉淀置真空干燥器干燥，編號(hào)為P4；第3份沉淀6 g加50 mL蒸餾水，在50 ℃加熱復(fù)溶后，真空冷凍干燥，編號(hào)為P5。

1.3.2.2 大孔樹脂脫色

精確稱取一定量的樣品P4，加蒸餾水配成3 mg/mL的樣品溶液，按料液比1∶5加入已處理的大孔樹脂D318，用5% HCl溶液將pH值調(diào)為6，于搖床上180 r/min振搖脫色3 h，脫色后抽濾收集濾液，濾液濃縮至50 mL左右，攪拌加入4 倍體積95%乙醇溶液，靜置6 h，4 000 r/min離心，沉淀用無(wú)水乙醇攪拌洗滌后離心，沉淀真空干燥，編號(hào)為P6。

1.3.2.3 雙氧水脫色

精確稱取P4樣品0.5 g，加蒸餾水溶解，配成5 mg/mL的多糖溶液100 mL，加入體積分?jǐn)?shù)為30%的雙氧水30 mL，在40 ℃保溫3 h脫色后濃縮至50 mL左右，攪拌加入4 倍體積95%乙醇溶液，靜置6 h，4 000 r/min離心，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌后真空干燥，編號(hào)為P7。

1.3.2.4 脫蛋白

精確稱取P4樣品1.0 g，加入蒸餾水150 mL使其完全溶解，按多糖溶液體積1/4加入氯仿-正丁醇混合液（4∶1，V/V），在分液漏斗中充分振搖后，3 600 r/min離心10 min，棄去中間層變性蛋白及下層有機(jī)溶劑，上清液按體積加入1/4有機(jī)混合液除蛋白，重復(fù)多次至無(wú)中間層變性蛋白。上清液濃縮后攪拌加入4 倍體積95%乙醇溶液，靜置6 h，4 000 r/min，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌后真空干燥，編號(hào)為P8。

1.3.3 賀蘭山野紫蘑菇多糖抗氧化活性的測(cè)定

1.3.3.1 DPPH法測(cè)定原理

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其孤對(duì)電子在517 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收（顯深紫色），當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，可與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，可通過(guò)分光光度法定量測(cè)定其減弱的程度，進(jìn)而判斷自由基清除劑的清除能力。自由基清除能力的大小用清除率表示，清除率越大，其抗氧化能力越強(qiáng)，VC是一種較強(qiáng)的抗氧化劑，作為陽(yáng)性對(duì)照。

DPPH在無(wú)水體系中的最大吸收波長(zhǎng)在517 nm左右，在有水體系中的最大吸收波長(zhǎng)在525 nm左右。本實(shí)驗(yàn)為有水體系，選用波長(zhǎng)為525 nm。

1.3.3.2 樣液配制

精密稱取DPPH 4 mg，用50%乙醇溶液溶解并定容到250 mL，精確稱量P1～P8號(hào)多糖樣品，分別配成質(zhì)量濃度為5.0、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156、0.078 mg/mL的溶液。

1.3.3.3 反應(yīng)步驟

分別取不同質(zhì)量濃度的樣品1 mL樣品液加入3 mL DPPH溶液，作為樣品管，反應(yīng)30 min，在525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為Ai；取1 mL蒸餾水加入3 mL DPPH溶液，作為空白管，反應(yīng)30 min，在525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為Ac；另分別取1 mL樣品液加入3 mL 50%乙醇溶液，作為對(duì)照管反應(yīng)30 min，在525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為Aj。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，精密稱取200.0 mg VC用蒸餾水定容到20 mL，取1 mL VC標(biāo)準(zhǔn)液加入3 mL DPPH溶液，作為陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)30 min，在525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以上各組設(shè)3個(gè)平行，結(jié)果取平均值，按如下清除率公式分別進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 分級(jí)醇沉對(duì)賀蘭山紫蘑菇多糖抗氧化活性的影響

在多糖溶液中，分次加入乙醇，使乙醇含量逐步增大，可以逐級(jí)沉淀出分子片段由大到小的多糖。在多糖水提液中加入95%乙醇溶液，當(dāng)乙醇終體積分?jǐn)?shù)達(dá)60%時(shí)，有絮狀沉淀析出，當(dāng)加大乙醇體積分?jǐn)?shù)到80%時(shí)，有細(xì)小沉淀析出。

如圖1所示，賀蘭山紫蘑菇多糖分級(jí)醇沉的不同組分均具有一定的抗氧化能力，但其活性都低于VC陽(yáng)性對(duì)照組，圖中相同質(zhì)量濃度條件下，P1對(duì)自由基清除率與P2相比具有顯著性差異（P＜0.05）。多糖的抗氧化能力與其質(zhì)量濃度有一定關(guān)系，質(zhì)量濃度在2.5 mg/mL時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，多糖質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，抗氧化能力無(wú)明顯變化，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度低于1.25 mg/mL時(shí)，抗氧化能力急劇下降，這可能與多糖清除自由基的機(jī)制有關(guān)[26]。且P2的抗氧化活性高于P1，說(shuō)明多糖的抗氧化活性與其平均相對(duì)分子質(zhì)量大小及空間結(jié)構(gòu)有密切聯(lián)系，P1的平均相對(duì)分子質(zhì)量略大于P2，大分子質(zhì)量的多糖其分枝龐大，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可能不利于與自由基結(jié)合，分子質(zhì)量略小的多糖其結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，活性中心便于和自由基快速、緊密的結(jié)合。

2.2 不同干燥方式對(duì)賀蘭山紫蘑菇多糖抗氧化活性的影響

如圖2所示，采用不同方式干燥的賀蘭山紫蘑菇多糖均具有抗氧化活性，但都弱于陽(yáng)性對(duì)照組；抗氧化能力的高低與多糖質(zhì)量濃度有一定關(guān)系，多糖質(zhì)量濃度低于0.625 mg/mL時(shí)，不同方式干燥的多糖抗氧化能力相似，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度大于1.25 mg/mL時(shí)，樣品P4的抗氧化活性明顯強(qiáng)于P3、P5和P2，且在多糖質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，其抗氧化能力可達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照的65%左右。在3種干燥方式中，只用無(wú)水乙醇洗滌而不用丙酮、乙醚洗滌的樣品活性較好，這可能是由于用無(wú)水乙醇洗滌可以去除部分小分子單糖和寡糖以及一些脂溶性雜質(zhì)，能夠提高多糖的純度，因此活性略高；但用乙醚、丙酮等有機(jī)溶劑洗滌后，可能破壞了多糖的結(jié)構(gòu)，改變了多糖的空間構(gòu)象，從而影響了其抗氧化活性。并且，P2的活性要高于P5，這可能是在凍干時(shí)，多糖中原來(lái)與水分子形成的分子間氫鍵斷開，破壞了其空間結(jié)構(gòu)，影響其活性；或者由于水分子的升華，使其分子間隙液體濃縮，電解質(zhì)濃度增加，pH值改變，以上只是推測(cè)，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

2.3 不同脫色方法對(duì)賀蘭山紫蘑菇多糖抗氧化活性的影響大孔樹脂脫色是一種溫和的脫色方法，對(duì)多糖的抗氧化活性影響較小，而雙氧水脫色雖然脫色效果較好，但其對(duì)多糖的抗氧化活性的影響較大。如圖3所示，賀蘭山紫蘑菇多糖脫色和脫蛋白處理后均具有抗氧化活性，但都低于陽(yáng)性對(duì)照組；雙氧水脫色效果較好，但對(duì)活性影響很大，在低體積分?jǐn)?shù)時(shí)清除率還出現(xiàn)了負(fù)值，這是因?yàn)殡p氧水脫色僅是雙氧水與色素分子作用，改變了色素的生色基團(tuán)，并沒用去除色素分子，多糖含有較多的羥基、醛基等活性基團(tuán)，雙氧水還可以導(dǎo)致其氧化降解或者改變多糖的鏈狀結(jié)構(gòu)，使得多糖的有效質(zhì)量濃度降低，影響其生物活性[27]；綜合脫色效果和抗氧化活性等因素，大孔樹脂是一種較優(yōu)的脫色方法，能有效去除色素，并且脫色后多糖的抗氧化活性要高于脫色前，活性增加，這可能是由于大孔樹脂吸附了色素分子及其他小分子雜質(zhì)，一定程度上純化了多糖[28]。

2.4 不同脫蛋白方法對(duì)賀蘭山紫蘑菇多糖抗氧化活性的影響80%醇沉的多糖抗氧化活性強(qiáng)于60%醇沉組分，這可能是由于80%醇沉的相對(duì)分子質(zhì)量略大于60%醇沉的組分[29]，大分子質(zhì)量多糖分子體積較大，分枝過(guò)多，空間位阻較大，可能不利于活性中心的結(jié)合，而分子片段較小的多糖由于其分枝結(jié)構(gòu)較少，空間位阻相對(duì)較小，更容易與活性中心結(jié)合；不同干燥方法對(duì)多糖的抗氧化活性有一定影響，本實(shí)驗(yàn)采用的3種干燥方法中，真空干燥（乙醇洗滌）對(duì)抗氧化活性的影響最小，而且此方法較經(jīng)濟(jì)，耗時(shí)少，在擴(kuò)大生產(chǎn)中更具有可行性；采用不同脫色方法對(duì)多糖的抗氧化活性有不同的影響，大孔樹脂脫色對(duì)多糖的抗氧化活性影響較小，并且有較高的多糖保留率，雙氧水脫色對(duì)多糖抗氧化活性的影響較大，可能是多糖鏈中活潑的羥基和醛基易被雙氧水氧化，改變了多糖的空間結(jié)構(gòu)，降解了多糖；Sevag法脫蛋白對(duì)多糖的抗氧化活性影響較大，脫蛋白后多糖的抗氧化活性大大降低，其最大抗氧化能力為處理前的24%左右，這可能是由于有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)變性時(shí)，一些與多糖結(jié)合的糖蛋白也變性除去，使得多糖的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。影響多糖抗氧化活性的因素很多，若想闡明其影響機(jī)制則需要更進(jìn)一步的研究。

如表1所示，大孔樹脂同時(shí)還具有較好的脫蛋白作用，其蛋白清除率僅次于Sevag法，但對(duì)多糖的抗氧化活性的影響較小，如圖4所示，Sevag法脫蛋白的過(guò)程會(huì)影響多糖的空間結(jié)構(gòu)，從而改變多糖的抗氧化活性。賀蘭山紫蘑菇多糖脫蛋白后具有抗氧化活性，但低于陽(yáng)性對(duì)照組；采用Sevag法脫蛋白處理后，多糖的抗氧化活性略有降低，這可能是由于氯仿、正丁醇等有機(jī)試劑在使蛋白變性的過(guò)程中影響了多糖分子的空間構(gòu)象，從而影響了其抗氧化活性。相比較而言，大孔樹脂脫蛋白的效果較好，并且對(duì)抗氧化活性的影響較小。

3 結(jié) 論

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Effect of Processing Method on Antioxidant Activity of Polysaccharides from Cortinarius purpurascens Fr.

LIU Jiting, LU Xiaoli, ZHANG Ziping*
(Key Laboratory of Ministry of Education for Conservation and Utilization of Special Biological Resources in the Western China, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

Crude polysaccharides with significant antioxidant activity were obtained from Cortinarius purpurascens Fr. by hot water extraction. Three drying methods, vacuum freeze drying, vacuum drying after washing only with absolute ethanol and vacuum drying after successive washing with absolute ethanol and other organic solvents were comparatively studied on the antioxidant activity of the fungal polysaccharides by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay after deproteinization by Sevag method, and discoloration by macroporous resin chromatography or hydrogen peroxide. Vacuum drying after washing only with absolute ethanol had the smallest effect on the antioxidant activity of the purified polysaccharides. Macroporous resin chromatography was an advantageous discoloration method over hydrogen peroxide. Sevag method exerted a significant negative effect on the antioxidant activity of the polysaccharides.

polysaccharides; drying method; discoloration; deproteinization; 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; antioxidant activity

Q539

A

1002-6630（2015）04-0006-05

10.7506/spkx1002-6630-201504002

2014-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（21162020）

劉繼婷（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：570054759@qq.com

*通信作者：張自萍（1970—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物。E-mail：zipingzhang@163.com