乳和乳制品中嗜冷菌及其耐熱酶的危害與控制研究

王嬌，張?bào)蓿?，劉術(shù)明，劉文麗

（1.黑龍江東方學(xué)院，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江貝因美乳業(yè)有限公司黑龍江安達(dá)151400）

乳和乳制品中嗜冷菌及其耐熱酶的危害與控制研究

王嬌1，張?bào)?，*，劉術(shù)明2，劉文麗2

（1.黑龍江東方學(xué)院，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江貝因美乳業(yè)有限公司黑龍江安達(dá)151400）

嗜冷菌是乳低溫貯藏中的主要腐敗菌，嗜冷菌及其代謝酶的存在直接影響原料乳的質(zhì)量，闡述了嗜冷菌及其耐熱酶類對(duì)乳及乳制品的危害，并通過(guò)分析嗜冷菌的適冷機(jī)理和影響酶活的因素，探討控制嗜冷菌及其代謝酶的方法，以保障原料乳質(zhì)量。

嗜冷菌；耐熱酶；危害；控制方法

嗜冷菌（Psychrotrophic bacteria）是指在6.5℃條件下，需氧培養(yǎng)10 d，在MPC瓊脂平板上形成可計(jì)數(shù)菌落的細(xì)菌、酵母和霉菌，嗜冷菌包含有假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、無(wú)色桿菌屬，黃桿菌屬和克雷伯氏菌屬等［1］，由于生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，原料奶需要在工廠貯存的時(shí)間隨之變長(zhǎng)，低溫貯藏時(shí)嗜冷菌大量生長(zhǎng)繁殖，因?yàn)榇蠖鄶?shù)嗜冷菌經(jīng)巴氏殺菌即可被殺死而往往被忽略，近年來(lái)，人們逐漸發(fā)現(xiàn)嗜冷菌在低溫條件下分泌的胞外蛋白酶、脂肪酶即使經(jīng)高溫處理仍能保留一部分活性，在低溫貯藏時(shí)酶的活性逐漸被激活，它能分解乳制品中的脂肪和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)品凝結(jié)、分層、產(chǎn)生苦味等不良品質(zhì)。

1　嗜冷菌及其耐熱酶對(duì)乳及乳制品的危害

1.1對(duì)原料乳的危害

低溫貯藏時(shí)，原料乳中的嗜冷菌大量生長(zhǎng)繁殖，嗜冷菌的繁殖過(guò)程中會(huì)代謝產(chǎn)生脂肪酶和蛋白酶，這些酶會(huì)導(dǎo)致乳中脂肪和蛋白質(zhì)的分解。張甦［2］研究證明在4℃下貯存44 h～48 h時(shí)嗜冷菌數(shù)量最多并發(fā)生明顯質(zhì)變，如乳清析出、蛋白凝結(jié)和不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生，此外，王輝［3］、任靜［4］、岳喜慶［5］等分析了酶活力與嗜冷菌數(shù)之間的關(guān)系，認(rèn)為菌數(shù)與酶活力呈正相關(guān)，并證明菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，酶活即穩(wěn)步增長(zhǎng)，原料乳的質(zhì)量也隨之下降。

1.2對(duì)乳制品的危害

關(guān)于嗜冷菌代謝產(chǎn)生酶對(duì)乳制品質(zhì)量的影響目前研究較多集中在其對(duì)UHT乳質(zhì)量方面，Patricia Munsch-Alatossava［6］等研究證明，嗜冷菌代謝產(chǎn)生的脂肪酶會(huì)分解UHT乳中的脂肪球膜釋放游離脂肪酸，導(dǎo)致脂肪上浮，pH值逐漸下降，蛋白酶能分解乳蛋白導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)苦并引起黏度的變化而形成膠凝，口感風(fēng)味變差，貨架期變短，張書文［7］、趙澤民［8］等研究證明，嗜冷菌產(chǎn)生的酶可導(dǎo)致UHT乳色澤的改變以及焦糖化反應(yīng)加劇。姚春燕［9］提出嗜冷菌可導(dǎo)致干酪產(chǎn)量下降且呈現(xiàn)軟而粘稠的組織結(jié)構(gòu)，表面出現(xiàn)斑點(diǎn)、產(chǎn)生腐爛及腐敗氣味等，用接種了嗜冷菌的原料乳制作酸奶，結(jié)果酸奶的風(fēng)味很差。此外，奶粉的結(jié)塊、發(fā)苦等不良品質(zhì)也被認(rèn)為與嗜冷菌有關(guān)。

2　嗜冷菌產(chǎn)生的酶

2.1蛋白酶

嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶可分為三類：胞內(nèi)蛋白酶、胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶，菌體被殺死后，胞內(nèi)蛋白酶釋放到乳中影響產(chǎn)品的品質(zhì)，早在1984年，Kough［10］等就證明UHT奶發(fā)生膠凝與嗜冷菌產(chǎn)生的胞內(nèi)蛋白酶有關(guān)，但目前研究較多的是胞外蛋白酶，主要是假單胞菌屬產(chǎn)生的耐熱的堿性金屬蛋白酶，Zn2+和Ca2+構(gòu)成酶活中心，分子量40 kD～50 kD，一般出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，最適溫度和pH分別為30℃～40℃和6～8，它能優(yōu)先水解к-酪蛋白，使其失去對(duì)酪蛋白膠束的穩(wěn)定作用，從而導(dǎo)致產(chǎn)品凝乳、分層等。

國(guó)外對(duì)嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶的耐熱性研究較早，1981年，Griffiths［11］等就通過(guò)研究13株假單胞菌產(chǎn)生的蛋白酶的熱穩(wěn)定性后得知這些蛋白酶經(jīng)77℃，15 s的熱處理仍然可保留55%～65%的活性，140℃加熱5 s后仍能保留20%～40%的活性，而Adams［12］的研究也表明熒光假單胞菌MC60產(chǎn)生的蛋白酶在149℃的耐熱能力是嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的4 000倍，均證明該蛋白酶對(duì)熱有極高的穩(wěn)定性。

2.2脂肪酶

部分嗜冷菌產(chǎn)生的脂肪酶極其耐熱，殘留的脂肪酶能分解脂肪釋放的游離脂肪，這些游離脂肪在脂肪球的相互碰撞中起到粘合劑的作用，從而產(chǎn)生脂肪球簇而上浮，導(dǎo)致乳質(zhì)量的變化［13］，假單胞菌產(chǎn)生的脂肪酶最適pH 8～9，多數(shù)在常乳中具有相當(dāng)大的活性，最適反應(yīng)溫度為30℃～50℃，但有些在1℃～8℃，甚至更低的-10℃～-30℃也能引起乳制品腐敗變質(zhì)，因此控制脂肪酶的產(chǎn)生至關(guān)重要。

2.3半乳糖苷酶

除蛋白酶和脂肪酶外，嗜冷菌還能產(chǎn)生部分半乳糖苷酶，半乳糖苷酶能水解含半乳糖苷鍵的物質(zhì)，如乳糖等，引起乳品質(zhì)的變化。半乳糖苷酶與蛋白酶和脂肪酶一樣，含有其他嗜溫酶類不具有的氨基酸殘基，可提高酶的耐熱性。

3　控制嗜冷菌及其酶活性的方法

3.1酶耐熱和嗜冷菌的適冷機(jī)理

目前，對(duì)嗜冷菌代謝產(chǎn)生的酶的耐熱原因的研究相對(duì)較少，楠丁呼思勤［14］等在總結(jié)中外研究的基礎(chǔ)上認(rèn)為這些酶的耐熱特性可能與其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)如氨基酸組成、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、氫鍵、共價(jià)鍵等有關(guān)，但其精確的耐高溫機(jī)理還不清楚。嗜冷菌的適冷代謝機(jī)理方面，李晶等［15］認(rèn)為，嗜冷菌之所以能保持在低溫環(huán)境下的生長(zhǎng)代謝，與其特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)，可支持其在在低溫下吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、正常產(chǎn)酶并保持酶的高活性。

3.2嗜冷菌及其代謝酶活的測(cè)定

3.2.1嗜冷菌的檢測(cè)

目前對(duì)于嗜冷菌計(jì)數(shù)的方法較多，傳統(tǒng)方法采用IDF推薦的PMC瓊脂平板在6.5℃培養(yǎng)10 d之后計(jì)數(shù)，這種方法相對(duì)準(zhǔn)確，成本較低，但培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，不利于工廠的實(shí)際應(yīng)用，IDF同時(shí)提出了嗜冷菌的快速檢測(cè)方法：21℃培養(yǎng)25 h，但其結(jié)果只是估計(jì)值，不夠準(zhǔn)確，且該方法并未進(jìn)行特異性篩選，21℃中存在嗜溫菌生長(zhǎng)的可能性，使檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定；Maurilio［16］對(duì)apr基因設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，并利用PCR技術(shù)擴(kuò)增假單胞菌屬的apr基因，可以檢測(cè)105cfu/mL的復(fù)原脫脂乳中的擴(kuò)增產(chǎn)物，關(guān)晶巖［17］在此基礎(chǔ)上確立了DNA提取的最佳方法并建立了兩種基于PCR和熒光定量技術(shù)的原料乳中嗜冷菌計(jì)數(shù)的方法：16SrRNA-PCR計(jì)數(shù)法和apr-PCR計(jì)數(shù)法；Solimar Gon?alves Machado［18］等提出用PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)原料乳中嗜冷菌，Danilo Ercolini［19］等采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA-PCR技術(shù)對(duì)原料乳中的嗜冷菌進(jìn)行分子鑒定，李琳等［20］在研究各種快速檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上分別分析了直接外熒光過(guò)濾（DEFT）、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)（FCM）、實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)（RTPCR）、熒光原位雜交探針（FISH）、瞬時(shí)溫度梯度凝膠電泳（TTGE）、ATP生物發(fā)光等技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，為實(shí)際應(yīng)用提供參考。

除了直接對(duì)嗜冷菌進(jìn)行檢測(cè)，Uelinton Manoel Pinto［21］等通過(guò)檢測(cè)革蘭氏陰性嗜冷菌中高絲氨酸內(nèi)酯的量來(lái)間接反應(yīng)嗜冷菌的量。

3.2.2嗜冷菌代謝酶活性的檢測(cè)

根據(jù)酶活力的定義，可通過(guò)測(cè)定底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)測(cè)定酶的活力，一般測(cè)定嗜冷菌蛋白酶的方法有福林-酚、瓊脂擴(kuò)散、茚三酮、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）等。近兩年又開(kāi)始運(yùn)用RP-HPLC和熒光胺方法，但這些方法在使用上都存在局限性，王輝［22］等提出了用Azocasein法測(cè)定嗜冷菌耐熱胞外蛋白酶活性的方法，并得出波長(zhǎng)345 nm，酶與底物反應(yīng)時(shí)間2 h，TCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，TCA終止反應(yīng)后溶液靜置時(shí)間30 min為最佳反應(yīng)條件，該方法檢出限好，操作簡(jiǎn)單，是檢測(cè)乳中嗜冷菌代謝蛋白酶活性的理想方法。脂肪酶活性的測(cè)定方法較多，針對(duì)乳中嗜冷菌代謝產(chǎn)生的脂肪酶的測(cè)定，王歡等［23］比較了羅丹明平板法、橄欖油乳化法、對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶水解酶活和對(duì)硝基苯酚法測(cè)脂肪酶酯合成酶活4種常用的脂肪酶活力測(cè)定方法，認(rèn)為對(duì)硝基苯酚法重現(xiàn)性好，適用于脂肪酶活力的定量檢測(cè)。

3.3控制措施

有研究證明［7］，4℃下儲(chǔ)存的原料奶，如果初始嗜冷菌數(shù)小于5×104cfu/mL，則儲(chǔ)存4 d后，嗜冷菌數(shù)小于1×105cfu/mL，若大于5×104cfu/mL，則4 d后嗜冷菌數(shù)大于5×105cfu/mL，由此可見(jiàn)，低溫的抑制效果取決于原奶中嗜冷菌的初始含量，所以，控制原奶中嗜冷菌的數(shù)量顯得尤為重要，牧場(chǎng)的環(huán)境衛(wèi)生是控制乳中嗜冷菌數(shù)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，牧場(chǎng)牛舍空氣，草屑，牛糞等均藏有大量的嗜冷菌［24］，因此擠奶前對(duì)牧場(chǎng)環(huán)境和牛體衛(wèi)生的處理非常必要；而相同的原料奶在2℃儲(chǔ)存比在4℃儲(chǔ)存生產(chǎn)出的UHT乳保質(zhì)期更長(zhǎng)，可采用深度冷藏的方法減少嗜冷菌及其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生；郭奇慧等［25］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明UHT乳中纖維蛋白酶活力、蛋白沉淀量、下層蛋白粒徑、游離氨基氮含量隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，同時(shí)，4℃下嗜冷菌的平均代時(shí)一般為8 h～9 h［9］，縮貯存時(shí)間也是控制嗜冷菌產(chǎn)生酶的有效方法。

劉美鳳［26］研究了加壓CO2對(duì)熒光假單胞菌的殺菌效果，證明加壓CO2可以延長(zhǎng)細(xì)菌的延遲期，姚春艷［9］研究了CO2對(duì)延長(zhǎng)農(nóng)家干酪保質(zhì)期的作用，證明其對(duì)假單胞菌屬、腸桿菌屬和乳酸菌均有一定的抑制作用，岳喜慶，李鵬［27］研究了乳酸鏈球菌素和EDTA對(duì)原料乳保鮮的作用，認(rèn)為其能延長(zhǎng)原料乳的保藏時(shí)間，王蕊等［28］、劉芳等［29］、喻東威等［30］分別研究了超聲波、殼寡糖對(duì)原料乳保鮮的作用，認(rèn)為它們均能在一定程度上抑制原料乳中嗜冷菌的生長(zhǎng)，Mahmoud Sitohy［31］等研究證明在4℃下水牛乳中加入0.5%酯化大豆蛋白能顯著抑制嗜冷菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酸能力和蛋白分解能力，添加酯化大豆蛋白后酪蛋白的分解時(shí)間由2 d延長(zhǎng)為10 d。Patricia Munsch-Alatossava［6，32］等等研究了N2對(duì)原料乳中嗜冷菌及其代謝酶的抑制作用，證明在6、7、12℃均能有效抑制乳中嗜冷菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)乳的保藏時(shí)間。

酶活性方面，溫度和pH是影響酶活的關(guān)鍵因素，多數(shù)嗜冷菌代謝產(chǎn)生的蛋白酶的最適溫度和pH為30℃～40℃和6～8，脂肪酶的最適溫度和pH分別為30℃～50℃和8～9。其中pH對(duì)其影響更大，適當(dāng)調(diào)節(jié)可以部分抑制酶活性，但不能使之完全失活，對(duì)企業(yè)來(lái)說(shuō)，最有效的方法還是從源頭控制嗜冷菌的數(shù)量，并減少其代謝酶的產(chǎn)生。

4　結(jié)論與討論

嗜冷菌代謝產(chǎn)生的酶對(duì)乳及乳制品的品質(zhì)有很大的影響，目前的研究多集中在對(duì)嗜冷菌及其代謝酶的檢測(cè)方面，對(duì)嗜冷菌的控制也多為理論研究，如添加抑菌物質(zhì)等，較少能應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，對(duì)乳品企業(yè)來(lái)說(shuō)，做好源頭控制，減少嗜冷菌的帶入是最直接的控制措施，同時(shí)做好深度冷藏，減少貯藏時(shí)間，以減少耐熱酶的產(chǎn)生，對(duì)乳制品的品質(zhì)至關(guān)重要。

研究證明嗜冷菌代謝產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶對(duì)乳及乳制品的品質(zhì)有較大的影響，因此，所以加強(qiáng)對(duì)蛋白酶和脂肪酶特性的研究比單純研究嗜冷菌本身更有意義。

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Hazard Analysis and Control of Psychrotrophic Bacterias and Heat Resistant Enzymes in Raw Milk and Dairy Products

WANG Jiao1，ZHANG Yun1，*，LIU Shu-ming2，LIU Wen-li2
（1.East university of Heilongjiang，Haerbin 150086，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Beingmate Dairy Co.，Ltd.，Anda 151400，Heilongjiang，China）

Psychrotrophic bacteria is the primary putrefying bacteria in low-temperature storage raw milk，Psychrotrophic bacteria and the thermostable enzymes they made have enormous implications on raw milk，in this article，the perniciousness Psychrotrophic bacteria and the thermostable enzymes they made to milk and dairy products are introduced，by analyze the mechanism how Psychrotrophic bacteria can live in low temperature and the factors that influence the enzymes'activities，investigate the methods to control Psychrotrophic bacteria and the enzymes they produce to guarantee the quality of raw milk.

Psychrotrophic bacteria；thermostable enzymes；perniciousness；control methods

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.038

2014-03-04

王嬌（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：乳品質(zhì)量安全。