異種胰島移植的臨床前期研究進(jìn)展

徐 均，鄧紹平

(1.川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院肝膽外科細(xì)胞移植中心，四川 成都 610072)

異種胰島移植的臨床前期研究進(jìn)展

徐 均，鄧紹平

(1.川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院肝膽外科細(xì)胞移植中心，四川 成都 610072)

隨著對糖尿病治療方法的研究進(jìn)展，異種胰島移植已被重新認(rèn)識。筆者綜述異種胰島移植的異種胰島來源、胰島移植物的制備及鑒定、主要的免疫排斥反應(yīng)及其防治措施。

胰島移植；異種；糖尿病/外科學(xué)

胰島移植不僅能逆轉(zhuǎn)糖尿病動物的高血糖狀態(tài)，而且能防止糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。但供體的嚴(yán)重短缺極大阻礙了臨床胰島移植的發(fā)展。胰島細(xì)胞移植重建胰島的分泌系統(tǒng)[1]，已被確認(rèn)是唯一一種徹底根治糖尿病的治療方法[2]。然而同種異體胰島細(xì)胞移植受到限制，無法滿足廣大糖尿病患者的需要。目前異種胰島移植已成為移植界一個新的研究熱點，對移植物進(jìn)行移植前處理，可以降低移植物免疫原性、提高抗免疫能力、增強胰島細(xì)胞功能和擴大移植物數(shù)量。本文就異種胰島移植供體選擇、移植部位的選擇、胰島細(xì)胞的功能活性、移植物的制備與純化、移植后排斥反應(yīng)與防治措施等方面的進(jìn)展作一綜述。

1 移植供體的選擇

對異種移植而言，用作異種移植供體的動物不僅要求是轉(zhuǎn)基因動物，更要求是純系動物。1996年，我國國家科委“863”計劃立項開展轉(zhuǎn)人DAF基因和α2 gT基因豬研究，揭開了我國開發(fā)異種供體源的序幕。1997年，國家自然科學(xué)基金委員會將豬 →人異種移植基礎(chǔ)研究列為重大攻關(guān)項目，現(xiàn)正在加緊實施。豬易于飼養(yǎng)繁殖，一胎多生，成熟周期短，數(shù)量多，繁殖特性使人們可以有效地培育其近交系，具備在潔凈環(huán)境下大量培育遺傳工程供體等優(yōu)點。由于豬與人的胰島素結(jié)構(gòu)較為接近，且豬胰島素已成功地應(yīng)用于臨床達(dá)數(shù)十年之久，充分證明其糾正糖尿病高血糖狀態(tài)的安全性和有效性，故成為臨床異種胰島移植中最有希望的動物供體來源之一[3，4]。

2 移植部位的選擇

選擇合適的移植部位對植入胰島的存活、防止排斥均有重要影響[5]，胰島移植的部位主要為門靜脈、腎被膜下、皮下、肌肉、脾、胰腺、腹膜、網(wǎng)膜囊、胃腸壁、睪丸、胸腺、骨髓、眼前房和腦室等[6～8]。目前，國內(nèi)外對胰島理想移植部位的認(rèn)識不一。1972 年，Ballinger 等首次報道將分離的大鼠胰島細(xì)胞400～ 600 個經(jīng)腹腔移植給糖尿病大鼠，成功地逆轉(zhuǎn)了糖尿病。1973 年，Kemp 等[9]比較了經(jīng)門靜脈與經(jīng)腹腔移植胰島細(xì)胞的存活與功能的差異性，即移植部位的不同將影響胰島細(xì)胞的生存與功能的發(fā)揮。隨后，探索胰島細(xì)胞移植的理想部位也得到廣泛研究，如經(jīng)脾靜脈移植胰島、或經(jīng)肌肉移植胰島、或經(jīng)腹腔移植胰島等分別在狗和猴的糖尿病模型中得到研究。多數(shù)結(jié)果表明，經(jīng)門靜脈移植的胰島細(xì)胞停留在肝內(nèi)的存活率與功能均優(yōu)于其他的移植部位，是目前胰島細(xì)胞移植的首選部位[10]。

3 豬胰島細(xì)胞的制備與純化

3.1 胰島細(xì)胞的制備 自1990年Ricordi發(fā)明自動化消化技術(shù)以來，膠原酶灌注消化法[11]成為國際上流行的一種胰島細(xì)胞分離方法。近年也有學(xué)者采用手工的靜態(tài)兩步消化法分離豬胰島：首先將用膠原酶液膨脹的胰腺放在冰水(冷消化)，然后不加振動在37 ℃水槽里孵育消化(熱消化)，也取得了較高的胰島產(chǎn)量。胎豬與新生豬胰腺所含的外分泌組織較少，一般采用剪碎加酶消化胰腺組織法。成年豬胰腺結(jié)締組織較多，故而胰島細(xì)胞的分離提取相對較難，方法也多種多樣，但基本上還是采用Ricordi等所確立的分離模式。

3.2 胰島細(xì)胞的純化 成年豬胰島細(xì)胞分離后需經(jīng)過純化方可移植。間斷密度梯度離心是常用的純化方法，可用作梯度介質(zhì)的物質(zhì)有：聚蔗糖(Ficoll)、Dextran、Perc011、Nycodez和蔗糖等[12～14]。目前主要是采用Ficoll作為密度分離介質(zhì)來純化胰島，但其含有的內(nèi)毒素可能對細(xì)胞功能有較大的不良影響，因而并不適用于臨床移植實驗。碘克沙醇(Iodixanol)作為臨床上廣泛使用的造影劑，具有低內(nèi)毒素、等滲透壓、對細(xì)胞損傷少等優(yōu)點。本研究小組的實驗結(jié)果表明[15]，與Ficoll-400分離液相比，Iodixanol混合液可顯著提高成年豬胰島細(xì)胞的產(chǎn)量、活性及胰島素的分泌，可成為Ficoll分離液純化的替代方案。近年來，隨著半自動與自動分離法的出現(xiàn)，進(jìn)一步提高了胰島收獲量，達(dá)160000～440000 IEQ，為開展前期臨床實驗奠定了堅實的基礎(chǔ)。

4 胰島細(xì)胞的功能活性鑒定

胰島細(xì)胞的功能活性目前常用以下幾種方法測定：①組織形態(tài)學(xué)染色。目前最常使用的是雙硫腙(DTZ)法。②體外葡萄糖刺激胰島素分泌試驗。分為靜止態(tài)刺激試驗和灌注法。即通過測定胰島細(xì)胞在不同濃度葡萄糖環(huán)境中分泌胰島素的能力及環(huán)境中的葡萄糖水平，以判斷胰島細(xì)胞的活性。③胰島組織培養(yǎng)液中胰島素含量測定。可采用放射性免疫法或酶聯(lián)免疫法。④熒光染色。采用叮啶橙(acridine orange，AO)和碘丙啶(propidium iodide，PI) 染色，熒光鏡下觀察，活細(xì)胞染成綠色，死細(xì)胞染紅色；可以鑒別活性與無活性胰島。⑤動物實驗。將分離純化后的胰島細(xì)胞移植于糖尿病動物模型體內(nèi)，觀察其逆轉(zhuǎn)高血糖狀態(tài)的能力[16～18]。目前常用的方法缺乏特異性。幾種新的技術(shù)手段仍在探索中，如測定胰島的氧耗率(oxygen consumption rate，OCR)、ATP/ADP比率、ATP/DNA 比率[19]等反映其胰島細(xì)胞線粒體膜的完整性和功能。因此，目前對胰島細(xì)胞質(zhì)量的評估和移植預(yù)后的判斷在一定程度上仍依賴實踐經(jīng)驗的積累。

5 移植后的排斥反應(yīng)防治

組織或細(xì)胞移植(如胰島移植) 的主要障礙之一是移植排異反應(yīng)，解決這個問題的方法之一是使用免疫抑制劑，但這會使患者處于免疫力低下風(fēng)險中；另一種解決方法是免疫隔離及免疫耐受。

5.1 免疫隔離 克服免疫排斥反應(yīng)是細(xì)胞移植治療的關(guān)鍵問題。作為免疫隔離屏障的微囊為克服細(xì)胞移植治療疾病研究中的免疫排斥反應(yīng)和移植物來源稀少問題提供了新的途徑。微囊壁是半通透性的膜結(jié)構(gòu)，只允許小分子物質(zhì)(包括囊外營養(yǎng)物質(zhì)和囊內(nèi)細(xì)胞代謝產(chǎn)物) 自由通過，這樣可維持移植物長期存活避免免疫細(xì)胞和抗體攻擊。微囊材料的主要作用是為移植物提供免疫保護環(huán)境，因而膜材料化學(xué)成分將直接影響微囊的生物相容性和物理穩(wěn)定性。膜材料主要有藻酸鹽多聚賴氨酸、瓊脂糖、脫乙酞己丁質(zhì)、聚丙烯胺及輕甲基纖維素鈉等。目前以海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微囊技術(shù)發(fā)展最為成熟。APA 具有較低的細(xì)胞毒性和較好的細(xì)胞豁附性、長期的穩(wěn)定性和較高的生物相容性等優(yōu)點。鑒于APA微囊仍然存在膜脆性強、難處理、高成本以及PLL的免疫原性和細(xì)胞毒性等缺點，最新的研究采用了可以提高微囊大小一致性及其穩(wěn)定性，增加囊壁厚的聚亞甲基二肌氯化氫(poly methylene co guanidine，PMCG)來代替聚賴氨酸(PLL)。研究證明，海藻酸鈉-聚亞甲基二肌·氯化氫-海藻酸鈉(alginate PMeo-alginate，A-PMCG-A)微囊比目前最常用的APA微囊強度更高，同時可以提供給細(xì)胞更充分更妥當(dāng)?shù)奈h(huán)境。微囊化胰島移植目前仍處于實驗階段，主要原因是移植物免疫排斥反應(yīng)和微囊異物反應(yīng)所致的纖維組織過度生長，這種纖維化將胰島和周圍環(huán)境隔離，影響微囊半透膜的通透性，導(dǎo)致胰島難以攝取氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，胰島因缺氧而死。

5.2 免疫耐受 雖然在小動物實驗研究及個別靈長類動物中已成功誘導(dǎo)了免疫耐受，但同樣的誘導(dǎo)方案卻難以在臨床得以實現(xiàn)?；谂懦夥磻?yīng)和耐受形成機理，人們探索了多種誘導(dǎo)方法。

5.2.1 外周性耐受 免疫耐受研究早期常應(yīng)用單克隆抗體(mAb)來阻斷T 細(xì)胞表面分子，如OKT3 針對T 細(xì)胞表面的CD3 分子，降低TCR 的表達(dá)；或利用抗CD4/ CD8-mAb 來清除循環(huán)中活化T細(xì)胞[20]，目前已開發(fā)了抗LFA-1 mAb 和ICAM-1 mAb，利用2個mAb 可阻斷T 細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞(APCs)間的結(jié)合，減輕對移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，減少血管并發(fā)癥的發(fā)生率。阻斷T 細(xì)胞活化的第一信號利用TCR 特異性抗體來阻斷TCR與MHC/抗原肽的結(jié)合，使T 細(xì)胞活化缺乏第一信號，從理論上來講是一種有效的方法[21～ 23]。但這種抗體只能針對某一特殊亞群TCR 的T 細(xì)胞，而無法完全阻斷參與抗原識別的所有T細(xì)胞，從而限制了其臨床應(yīng)用。阻斷T細(xì)胞活化的第2信號目前已有多條共刺激通路為人們所認(rèn)識，如B7-1/ B7-2-CD28、CD40/ CD40L(CD154，gp39)、誘導(dǎo)型共刺激分子(ICOS)等，其中前2種研究最多。利用抗-CD40/CD40L mAb 和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞相關(guān)抗原4免疫球蛋白(CT LA4-Ig)等阻斷劑來阻斷上述信號通路使T細(xì)胞缺乏第2信號而無能，從而誘導(dǎo)供體特異性耐受是近年來研究最為活躍的領(lǐng)域[24，25]。但這些單抗在體內(nèi)半衰期短，不能長久發(fā)揮作用，因此人們又利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將表達(dá)CTLA4-Ig 和CD40-Ig 或CD40L-Ig 的重組腺病毒導(dǎo)入體內(nèi)，使其持續(xù)生成，有效地預(yù)防急、慢性排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)移植物耐受。

5.2.2 中樞耐受 中樞性耐受中目前研究較廣的為嵌合體形成誘導(dǎo)耐受。1993年，Starzl等[26]在長期存活的腎移植受者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了供體來源的異基因細(xì)胞，認(rèn)為它對移植物的長期存活很關(guān)鍵，把這種供、受體細(xì)胞共存、相互耐受的現(xiàn)象稱為“ 嵌合(chimerism)”。移植前人為輸注供體抗原，待受體建立異基因嵌合體并誘導(dǎo)特異性免疫耐受后再行目標(biāo)器官移植，使移植物“逃逸” 免疫損傷。目前，供體特異性骨髓細(xì)胞(dono r-specificbone marrow cells，DBMC)輸注已成為研究誘導(dǎo)移植免疫耐受的熱點。雖然大量的基礎(chǔ)實驗和臨床數(shù)據(jù)資料已證實DBMC 輸注可建立異基因嵌合體，可能成為最接近臨床的方法，但當(dāng)中也存在著許多爭論與尚無法解決的問題，如何把握DBMC 輸注方式、骨髓源的獲取，如何加深耐受狀態(tài)并長期維持嵌合狀態(tài)將是下一步研究的重點。

6 結(jié)論

異種移植治療糖尿病現(xiàn)已顯示出廣闊的應(yīng)用前景[27，28]，但如何獲取大量高質(zhì)量的功能性胰島細(xì)胞及有效地抑制異種免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，仍是異種胰島移植所面臨的主要問題[29，30]。

[1] 張偉杰，夏穗生.臨床胰島移植研究進(jìn)展[J].臨床外科雜志，2008，16(1)：52-54.

[2] 鄒一豐，吳小劍，何曉生，等.異種胰島移植研究進(jìn)展[J].中華器官移植雜志，2007，28(3)：189-191.

[3] Prabhakaran S，Hering BJ.What strain of pig should be used[J].Xenotransplantation，2008，15：83-86.

[4] Marigliano M，Bertera S，Grupillo M，et al.Pig-to-nonhuman primates pancreatic islet xenotransplantation：an overview[J].Curr Diab Rep，2011，11：402-412.

[5] 王東梅，宋長興，張志欣.克服異種移植免疫排斥的研究進(jìn)展[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2009，23(1)：106-110.

[6] Rajab A.Islet transplantation：alternative sites[J].Curr Diab Rep，2010，10(5)：332-337.

[7] Salazar-Bauelos A，Benitez-Bribiesca L，Sigalet DL，et al.Bonemarrow as a site for pancreatic islet transplantation[J].Blood，2010，115(17)：3643-3644.

[8] Perez VL，Caicedo A，Berman DM，et al.The anterior chamber ofthe eye as a clinical transplantation site for the treatment of diabetes：a study in a baboon model of diabetes[J].Diabetologia，2011，54(5)：1121-1126.

[9] 黃孝倫.胰島細(xì)胞移植治療糖尿病的歷史、現(xiàn)狀與未來[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2012，19(2)：125-127.

[10]Merani S，Toso C，Emamaullee J，et al.Optimal implantation sitefor pancreatic islet transplantation[J].Br J Surg，2008，95(12)：

[11]Solari MG，Srinivasan S，Boumaza I，et al.Marginal mass islet transplantation with autologous mesenchymal stem cells promotes long-term islet allograft survival and sustained normoglycemia[J].J Autoimmun，2009，32(2)：116-124.

[12]Vergani A，D'Addio F，Jurewicz M，et al.A novel clinically relevantstrategy to abrogate autoimmunity and regulate alloimmunity inNOD mice[J].Diabetes，2010，59(9)：2253-2264.

[13]Qiao AY，Zhang WH，Chen XJ，et al.Isolation and purifi cation of islet cells from adult pigs[J].Transplant Proc，2010，42(5)：1830-1834.

[14]Min T，Yi L，Chao Z，et al.Superiority of visipaque(iodixanol)-controlled density gradient over Ficoll-400 in adult porcine islet purifi cation[J].Transplant Proc，2010，42(5)：1825-1829.

[15]Min T，Yi L，Chao Z，et al.Superiority of visipaque(iodixanol)-controlled density gradient over Ficoll-400 in adult porcine islet purification[J].Transplant Proc，2010，42：1825-1829.

[16]Shawl AI，Park KH，Kim UH.Insulin receptor signaling for the proliferation of pancreatic β-cells：involvement of Ca2+ second messengers，IP3，NAADP and cADPR[J].Islets，2009，1(3)：216-223.

[17]Dekki N，Nilsson R，Norgren S，et al.Type 1 diabetic serum interferes with pancreatic beta-cell Ca2+-handling[J].Biosci Rep，2007，27(6)：321-326.

[18]Corbin KL，Hall TE，Haile R，et al.A novel fl uorescence imaging approach for comparative measurements of pancreatic islet function invitro[J].Islets，2011，3(1)：14-20.

[19]Zamaraeva MV，Sabirov RZ，Maeno E，et al.Cells die withincreased cytosolic ATP during apoptosis：a bioluminescencestudy with intracellular luciferase[J].Cell Death Differ，2005，12(11)：1390-1397.

[20]Wang Z，Davies JD.CD8 blockade p rom otes an tigen resp onsivenesst o nont olerizing ant igen in tolerant mice by inhibi tingapop tosi s of CD4+ T cel ls [J].J Immu nol，2007，178(10)∶6148.

[21]Fi lby A，S eddon B，Kleczkow sk a J，et al.Fyn regu lates th eduration of T CR engagem ent n eeded f or com mitmen t t o ef fect orfun cti on [J].J Immu nol，2007，179(7)∶4635.

[22]Foell J，Hewes B，Mittler RS.T cell cos tim ulat ory and in hibit ory recept ors as therapeut ic targets f or inducing anti-tumo r immunit y [J].Cu rr Cancer Drug Targets，2007，7(1)∶55.

[23]Scharpf J，St rome M，Siemionow M.Im munomodul at ion w ithant i-alphabeta T-cell recept or monocl onal an tib odies in combination wi th cyclospo rin e A im proves regenerat ion in nerve allog raf t s [J].Mi crosurgery，2006，26(8)∶599.

[24]Lee JH，Ha J，Kim SH，et al.IL-2 pathway blocking in combination with anti-CD154 synergi stically establi shes mixed macrochimerismwith limited dose of bone marrow cells and prolongs skin graf tsu rvival in mice [J].J Korean Med Sci，2006，21(6)∶1005.

[25]Chavez H，Beaudreuil S，Abbed K，et al.Absence of CD4CD25 regulatory T cell expansion in renal transplanted patients treated invivo with Belat acept mediated CD28-CD80/86 blockade[J].Transpl Immunol，2007，17(4)∶243

[26]Li ZL，Xue WJ，Tian PX，et al.Prolongation of islet allograft survival by coexpression of CT LA4Ig and CD40LIg inmice [J].Transplant Proc，2007，39(10)∶3436.

[27]Elliott RB，Escobar L，Tan PL，et al.Live encapsulated porcine islets from a type 1 diabetic patient 9.5 yr after xenotransplantation[J].Xenotransplantation，2007，14：157-161.

[28]Elliott RB.Towards xenotransplantation of pig islets in the clinic[J].Curr Opin Organ Transplant，2011，16：195-200.

[29]Sachs DH，Sykes M，Yamada K.Achieving tolerance in pig-to-primate xenotransplantation：reality or fantasy[J].Transpl Immunol，2009，21：101-105.

[30]Ekser B，Cooper DK.Overcoming the barriers to xenotransplantation：prospects for the future[J].Expert Rev Clin Immunol，2010，6：219-230.

Preclinical research progress in islet transplantation

XU Jun，DENG Shao-ping

R657.5

B

1672-6170(2015)01-0152-03

2014-06-16；

2014-08-20)