茄子褐紋病病原鑒定及其生物學(xué)特性研究

吳仁鋒 楊紹麗 楊德枝

（武漢市蔬菜科學(xué)研究所，湖北武漢 430065）

茄子褐紋病病原鑒定及其生物學(xué)特性研究

吳仁鋒 楊紹麗 楊德枝

（武漢市蔬菜科學(xué)研究所，湖北武漢 430065）

2010～2011年采用室內(nèi)離體接種致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)鑒定方法對(duì)武漢市茄子褐紋病病原進(jìn)行研究，并測(cè)定了其相關(guān)生物學(xué)特性。從武漢市各茄子種植區(qū)采集茄褐紋病病樣，分離獲得來(lái)自茄子病株葉、莖、果等器官的15個(gè)生長(zhǎng)較一致的真菌分離物；經(jīng)致病性試驗(yàn)證實(shí)，分離物均為茄子褐紋病病原菌；經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，15個(gè)菌株均為Phomopsis vexans。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明：該病原菌最適生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為PDA和PSA，最適宜產(chǎn)孢培養(yǎng)基為燕麥培養(yǎng)基；菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25～30 ℃；最適pH值為4～7；光照有利于菌絲生長(zhǎng)；能夠利用多種碳源和氮源，碳源以麥芽糖利用效果最好，氮源以硝酸鈉利用效果最好；菌絲生長(zhǎng)的致死溫度為55 ℃ 25 min。

茄子；褐紋?。徊≡b定；生物學(xué)特性

茄子褐紋病（呂佩珂 等，2008）是一種世界性病害，在茄子生產(chǎn)中可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年此病害在湖北省也普遍發(fā)生，尤其露地栽培發(fā)生更為嚴(yán)重，從苗期到成株期均可受害（吳仁鋒，2011）。最為嚴(yán)重的是褐紋病對(duì)茄子采種危害甚大，許多田塊常因此病的大面積發(fā)生而導(dǎo)致種子嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收（中國(guó)農(nóng)作物病蟲(chóng)害編輯委員會(huì)，1979）。

為弄清湖北地區(qū)茄子褐紋病病原以及該病菌對(duì)不同理化環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件的需求，本試驗(yàn)對(duì)其病原進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，以期為研究該 病害的發(fā)生規(guī)律和防治技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

2010年和2011年在武漢市蔬菜科學(xué)研究所張家灣基地、黃陂武湖基地的茄子種植區(qū)采集感染茄子褐紋病的病樣，包括病葉、病莖及病果。

1.2 病原菌分離鑒定

病菌的組織分離（方中達(dá)，1998）：從試驗(yàn)田采取典型的病果、病莖及病葉，無(wú)菌水沖洗晾干，75%酒精消毒，無(wú)菌刀片切取病健交界處10 mm×10 mm的組織，用0.1%升汞溶液表面消毒3～5 min，無(wú)菌水沖洗3次，吸干組織塊表面水分，再將可能被殺死的組織剪去，接入PDA培養(yǎng)基，每皿3～5塊，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)觀察。菌絲萌發(fā)后，選典型菌落轉(zhuǎn)接3次，7 d后用內(nèi)徑為6 mm的打孔器從菌落邊緣打取菌餅，轉(zhuǎn)接于PDA平板上純化培養(yǎng)。待病菌長(zhǎng)出分生孢子器及分生孢子時(shí)，鏡檢觀察菌絲、分生孢子器及分生孢子的形態(tài)，并根據(jù)真菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行病原菌鑒定。

1.3 病原菌致病性測(cè)定

參照任錫倫和張漢卿（1993）的方法測(cè)定病原菌致病性，略作修改。孢子懸浮液制備：取實(shí)驗(yàn)室分離純化菌種，在PDA平板上培養(yǎng)至產(chǎn)生黑色分生孢子器，用消毒鑷子夾取分生孢子器，用消毒玻片碾壓散出分生孢子后用無(wú)菌水沖洗，充分混勻后，靜置片刻，取上清液，觀察分生孢子量，顯微觀察每個(gè)視野20個(gè)孢子左右，將剪好的5 mm×5 mm的濾紙片放入孢子液中，充分浸濕備用。接種方法：取在室內(nèi)驗(yàn)證的無(wú)病健果，用消毒解剖刀在健康無(wú)病的茄子果實(shí)上劃5 mm長(zhǎng)“十”字傷口，取上述濾紙片貼在“十”字傷口處，用噴壺噴水保濕。在25～28 ℃條件下保濕培養(yǎng)，7 d后調(diào)查結(jié)果。對(duì)照用無(wú)菌水接種。

病原菌的再分離：從接種發(fā)病部位的病健交界處，剪取10 mm×10 mm小塊病組織，用常規(guī)的組織分離法再次分離病原菌，鑒定PDA平板上長(zhǎng)出的病菌與接種用菌株形態(tài)是否一致，采用柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.4 病原菌生物學(xué)特性觀察

1.4.1 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 供試5種培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基（方中達(dá)，1998）、蛋白胨培養(yǎng)基（黃思良 等，1998）。將PDA平板上培養(yǎng)5 d的菌株HZ-4沿菌落邊緣用打孔器打取直徑6 mm的菌餅，分別移置不同培養(yǎng)基平板中央，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，3 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑，再培養(yǎng)7 d后測(cè)定產(chǎn)孢情況。

1.4.2 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 將PDA平板上培養(yǎng)5 d的菌株HZ-4沿菌落邊緣用打孔器打取直徑6 mm的菌餅，接種于PDA平板中央。置于25 ℃ HP250GS智能型人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置連續(xù)黑暗、12 h光暗交替、連續(xù)光照3個(gè)處理（光源為普通日光燈18 W，22 cm），每處理3次重復(fù)，3 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4.3 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 將PDA平板上培養(yǎng)5 d的菌株HZ-4沿菌落邊緣用打孔器打取直徑6 mm菌餅，接種于PDA平板中央。置于5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，3 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4.4 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值，分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。在不同pH值的平板上接種直徑為6 mm的菌餅，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4.5 碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（方中達(dá)，1998）。用含碳量相同的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、可溶性淀粉代替其中的30.0 g蔗糖，以不加碳作對(duì)照。用含氮量相同的尿素、硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、精氨酸代替其中的2.00 g硝酸鉀，以不加氮作對(duì)照。打取直徑為6 mm的菌餅，接種在不同碳、氮源平板中央，每處理3次重復(fù)。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4.6 菌絲致死溫度測(cè)定 將PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌株HZ-4沿菌落邊緣用打孔器打取直徑6 mm的菌餅，置于無(wú)菌試管中，加入2 mL無(wú)菌水。分別在45、50、55、60、65、70 ℃水浴鍋中分別處理10、15、20、25 min，取出試管迅速冷卻，將菌餅取出置于PDA平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)，3 d后觀察其生長(zhǎng)情況，每處理5次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

從田間采集茄子發(fā)病葉片、病莖及病果（圖1）。葉片受害后，先在下部葉片上出現(xiàn)蒼白色圓形斑點(diǎn)，發(fā)展擴(kuò)大后，病斑呈近圓形或不規(guī)則形，邊緣變?yōu)楹稚?，中間淺褐色或灰白色，其上輪生許多小黑粒點(diǎn)，后期病斑擴(kuò)大連片，常造成干裂、穿孔、脫落（圖1-a）。莖枝發(fā)病，病斑梭形，邊緣深紫褐色，中間灰白色凹陷，上生許多黑色小粒點(diǎn)，病斑發(fā)展后，病組織干腐，皮層脫落，露出木質(zhì)部，容易折斷，病斑多時(shí)，可連結(jié)成大的壞死區(qū)域（圖1-b）。果實(shí)受害，初期表現(xiàn)為淺褐色橢圓形凹陷斑，上生許多黑色小粒點(diǎn)，病斑不斷擴(kuò)大，可達(dá)半個(gè)果實(shí)，后期病斑發(fā)展為灰白色（圖1-c）。發(fā)病嚴(yán)重的，果實(shí)上可布滿病斑，尤其是留種茄（圖1-d），可導(dǎo)致顆粒無(wú)收。

圖1 茄子褐紋病田間發(fā)病癥狀

2.2 病原菌鑒定

按常規(guī)的組織分離法進(jìn)行分離，分離的病組織在PDA培養(yǎng)平板上培養(yǎng)5～7 d，轉(zhuǎn)皿純化。共獲得來(lái)自病葉、病莖及病果（圖2）的分離物15個(gè)。茄子褐紋病菌在PDA上，氣生菌絲細(xì)密，輪紋明顯，邊緣整齊（圖3）。培養(yǎng)10 d以上才有黑色分生孢子器產(chǎn)生，挑取黑色分生孢子器，載玻片上壓碎，鏡檢可以觀察到凸透鏡型有孔口的分生孢子器（圖4），壓破的分生孢子器有無(wú)數(shù)橢圓形或紡錘形孢子（α型分生孢子）從孔口溢出，尺寸為（5～8） μm×（2～8） μm，通常內(nèi)含2～3個(gè)油球（圖5）。參照真菌鑒定手冊(cè)（魏景超，1979）及中國(guó)真菌志（戚佩坤 等，2007），根據(jù)病害發(fā)生癥狀、菌落形態(tài)、分生孢子器及分生孢子形態(tài)，鑒定該病菌為擬莖點(diǎn)霉屬真菌Phomopsis vexans。

圖2 田間茄子病果上分生孢子器形態(tài)

圖3 茄子褐紋病菌在PDA上菌落形態(tài)

圖4 鏡檢茄子褐紋病菌分生孢子器形態(tài)

圖5 茄子褐紋病菌α型分生孢子形態(tài)

2.3 病原菌致病性測(cè)定

采用離體茄果進(jìn)行致病性測(cè)定。結(jié)果表明，接種分生孢子懸浮液的茄果不同程度的發(fā)病，對(duì)照無(wú)明顯癥狀。對(duì)已發(fā)病果實(shí)進(jìn)行常規(guī)組織分離，同樣可以分離得到和原來(lái)一樣的病菌，由此可以說(shuō)明分離得到的15個(gè)菌株均為引起茄子褐紋病的致病菌。

2.4 病原菌生物學(xué)特性觀察

2.4.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 茄子褐紋病菌菌株HZ-4在5種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀及產(chǎn)孢情況見(jiàn)表1。其中能夠產(chǎn)孢的培養(yǎng)基有 PDA、PSA、燕麥，其產(chǎn)孢量依次為燕麥＞PDA≥PSA，產(chǎn)孢時(shí)間均在10 d以上。菌絲生長(zhǎng)較好的培養(yǎng)基有PDA、PSA和燕麥，不適合菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為查氏和蛋白胨。

2.4.2 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 在PDA平板上連續(xù)黑暗、連續(xù)光照、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)3 d，茄子褐紋病菌菌落平均直徑分別為55.75、70.58、61.58 mm。說(shuō)明，光照條件較有利于菌絲的生長(zhǎng)（圖6）。

表1 茄子褐紋病菌菌株HZ-4在不同培養(yǎng)基上的菌落特征及產(chǎn)孢情況

2.4.3 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖7可以看出，在PDA平板上，茄子褐紋病菌菌絲在10～35 ℃下均能生長(zhǎng)；25～30 ℃為菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度，其中菌株在30 ℃時(shí)培養(yǎng)3 d菌落直徑最大達(dá)67.5 mm；菌絲在5 ℃和40 ℃下幾乎停止生長(zhǎng)。

圖6 不同光照對(duì)茄子褐紋病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖7 不同溫度對(duì)茄子褐紋病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4.4 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖8可以看出，在PDA平板上，pH值在3～12之間茄子褐紋病菌菌絲均可生長(zhǎng)，以pH值4～7最適；當(dāng)pH值為6時(shí)，菌絲生長(zhǎng)量最大；在pH值為12時(shí)，菌絲生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制?？傮w來(lái)看，偏酸的環(huán)境適宜茄子褐紋病菌菌絲生長(zhǎng)。

2.4.5 碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 從表2可以看出，菌株HZ-4對(duì)供試的7 種碳源均可利用，其中以麥芽糖利用效果最好，其次是葡萄糖、蔗糖，以不加碳源生長(zhǎng)最差，說(shuō)明碳源有利于菌絲生長(zhǎng)。菌株HZ-4對(duì)供試的6 種氮源均可利用，其中以硝酸鈉利用效果最好，其次是硝酸鉀、硝酸銨、氯化銨，對(duì)尿素的利用效果最差，以不加氮源生長(zhǎng)最快，說(shuō)明氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

2.4.6 菌絲致死溫度 由表3可以看出，在45、50 ℃水浴中分別處理 10、15、20、25 min，以及在55 ℃水浴中分別處理10、15 min的茄子褐紋病菌菌絲接種在PDA平板上都萌發(fā)形成新的菌落，經(jīng)55 ℃ 20 min處理的菌絲5個(gè)平板中僅1個(gè)能形成新的菌落，而經(jīng)55 ℃ 25 min處理的菌絲不能再繼續(xù)生長(zhǎng)，說(shuō)明茄子褐紋病菌菌絲的致死溫度為55 ℃ 25 min。

圖8 不同酸堿度對(duì)茄子褐紋病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表2 不同碳源、氮源對(duì)茄子褐紋病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表3 茄子褐紋病菌菌絲的致死溫度

3 結(jié)論與討論

經(jīng)病原菌分離和接種試驗(yàn)，證實(shí)引起本所張家灣基地和武湖基地的茄子褐紋病病原為半知菌亞門(mén)球殼孢目擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis vexans）。茄子褐紋病菌α型分生孢子呈橢圓形或紡錘形，通常內(nèi)含2～3個(gè)油球；β型分生孢子呈細(xì)長(zhǎng)線狀，并在一端彎曲成鉤，兩者均為無(wú)色單胞（魏景超，1979）。這兩種類(lèi)型的孢子可產(chǎn)生在同一分生孢子器內(nèi)。一般葉片上多為α型分生孢子，β型分生孢子較為少見(jiàn)，如有則多長(zhǎng)在莖稈及果實(shí)上。線狀分生孢子不能萌發(fā)。周永力等（1998）認(rèn)為油球是Phomopsis屬的一個(gè)穩(wěn)定特征，可作為該屬的判斷依據(jù)，溫度是產(chǎn)生不同孢子的主要因素，不同類(lèi)型孢子形態(tài)的產(chǎn)生與所發(fā)病植株的部位有關(guān)。本試驗(yàn)中分離得到的茄子褐紋病菌僅觀察到α型分生孢子，且油球多數(shù)情況下為2個(gè)（一端一個(gè)），在人工培養(yǎng)條件及自然發(fā)病條件下均未發(fā)現(xiàn)β型分生孢子。說(shuō)明自然狀態(tài)下α型分生孢子廣泛存在于寄主病莖、病葉及病果上。

生物學(xué)特性研究表明：PDA培養(yǎng)基適合培養(yǎng)褐紋病菌，燕麥培養(yǎng)基適合作為褐紋病菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)基和保存用。在PDA平板培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為25～30 ℃，適宜pH值為4～7，菌絲致死溫度為55 ℃ 25 min，光照有利于菌絲生長(zhǎng)。該菌能利用多種碳源和氮源，碳源以麥芽糖利用效果最好，在無(wú)碳培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最差；氮源以硝酸鈉利用效果最好，其次是硝酸鉀、硝酸銨、氯化銨，表明硝態(tài)氮較有利于該病原菌的生長(zhǎng)，可以利用該菌對(duì)氮源利用的差異來(lái)合理施肥，控制病害的發(fā)生。

經(jīng)病原菌的分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)鑒定以及柯赫氏法則驗(yàn)證，引起武漢市的茄子褐紋病的病原為Phomopsis vexans，是一種能夠以多種碳、氮源為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，適宜偏酸性環(huán)境的病原真菌。本試驗(yàn)研究了部分環(huán)境因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)該病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響，還需進(jìn)一步研究其他因子如相對(duì)濕度等對(duì)該菌生長(zhǎng)和發(fā)育的影響，以及分生孢子的生物學(xué)特性，為了解病菌侵染和病害流行奠定基礎(chǔ)。

方中達(dá)．1998．植病研究方法．3版．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社．

黃思良，趙艷珠，黃連江，韋剛．1998．不同培養(yǎng)基對(duì)芒果炭疽病菌分生孢子形成的影響．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，11（1）：62-66．

呂佩珂，蘇慧蘭，高振江，呂超．2008．中國(guó)現(xiàn)代蔬菜病蟲(chóng)原色圖鑒．呼和浩特：遠(yuǎn)方出版社．

戚佩坤，姜子德，向梅梅．2007．中國(guó)真菌志．北京：科學(xué)出版社．

任錫倫，張漢卿．1993．茄子（Solanum melongenaL.）對(duì)褐紋病菌（Phomopsis vexans）抗性的鑒定研究．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，15（2）：34-38．

魏景超．1979．真菌鑒定手冊(cè)．上海：上?？茖W(xué)出版社．

吳仁鋒．2011．茄褐紋病的識(shí)別與防治．長(zhǎng)江蔬菜，（13）：34-35．

中國(guó)農(nóng)作物病蟲(chóng)害編輯委員會(huì)．1979．中國(guó)農(nóng)作物病蟲(chóng)害．北京：農(nóng)業(yè)出版社：1403-1405．

周永力，呂國(guó)忠，劉偉成，白金鎧．1998．球殼孢目真菌個(gè)體發(fā)育研究Ⅰ：殼二孢等四屬．菌物系統(tǒng)，17（3）：199-205．

Studies on Identification of Eggplant Phomopsis Rot Caused by Phomopsis vexans and Its Biological Characteristics

WU Ren-feng，YANG Shao-li，YANG De-zhi
（Wuhan Vegetable Research Institute，Wuhan 430065，Hubei，China）

The morphological characteristics，pathogenicity and biological characteristics of the pathogens isolated from Eggplant phomopsis rot of Wuhan were studied．Large numbers of diseased eggplant samples were collected from different planting areas of Wuhan．Fifteen isolates of possible pathogenic fungi were isolated from leaves，stems and fruits of infected phomopsis rot plants．Based on the pathogenicity experiment，the results showed that the 15 isolates were the pathogens of Eggplant Phomopsis Rot disease．The morphological identification showed that 15 isolates werePhomopsis vexans．The results of studies on biological characteristics of pathogens showed that the optimum culture medium for mycelial growth were PDA and PSA，beneficial to spores culture medium were oats medium，the optimum temperature for mycelial growth were 25-30 ℃，and the optimum pH value were 4-7，and light promoted the growth of mycelial．The pathogen could make use of various carbon and nitrogen sources. Maltose was the best carbon source and sodium nitrate was the best nitrogen source．The lethal temperature for mycelial growth was 55 ℃ for 25 min.

Eggplant；Phomopsis rot；Pathogen identification；Bio1ogical characteristics

S436.411

A

1000-6346（2013）08-0080-06

2012-11-07；接受日期：2012-11-28

武漢市農(nóng)科院科技創(chuàng)新項(xiàng)目〔武農(nóng)科政（2011）63號(hào)〕

吳仁鋒，男，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事蔬菜病害診斷及綜合防控方面的研究，E-mail：wuhanwurenfeng@126.com