Wistar大鼠放射性腮腺損傷模型的建立

李海濤，李濤，董剛，盧恕來，鄭建金

(青島市市立醫(yī)院，山東青島266000)

隨著放射治療學(xué)的進(jìn)展，射線對正常組織的損傷給患者帶來一系列并發(fā)癥，如腺體、頜骨損傷，特別是唾液腺中腮腺唾液分泌減少、口腔干燥、吞咽困難等，增加患者的痛苦［1］。因此，預(yù)防和治療放射性腮腺損害已引起臨床醫(yī)師的重視。為了進(jìn)一步研究放射性腮腺損害的病因和診療方法，本研究將用Wistar大鼠以β射線外照射制成腮腺放射損傷模型，為今后進(jìn)一步研究放射性腮腺損傷及其藥物篩選提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及藥物 石蠟切片機(jī);恒溫烤箱;超凈工作臺(tái);光學(xué)顯微鏡;放療直線加速器;顯微成像系統(tǒng)。戊巴比妥鈉。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠25只，10～12周，體質(zhì)量280～300 g。由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(15只)和對照組(10只)。

1.3 放射性腮腺損傷模型制備 實(shí)驗(yàn)組大鼠采用40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，后將大鼠以側(cè)臥位束縛于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物固定板上實(shí)施照射，事先在右腮腺表面中心做染色標(biāo)記，以減小多次放射視野標(biāo)偏差。放射總劑量為40 Gy，放射源使用直線加速器(VARIAN，23EX，美國)6 MeV電子線，源皮距SSD 100 cm，劑量率DR 500 Mu/min。放射總劑量40 Gy，單次劑量500 cGy，2次/周。凝膠組織補(bǔ)償墊厚0.5 cm，以濾過低能射線，減輕皮膚等淺表組織的過度損傷，同時(shí)提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受射線能量的均衡度;1.2 cm鉛板設(shè)4孔，防護(hù)周圍正常組織，每孔照射視野1.6 cm×2.8 cm。照射孔經(jīng)劑量每孔中心點(diǎn)劑量差控制在－5% ～5%，相同照射深度條件下，照射對稱性－3% ～3%。對照組不進(jìn)行照射處理，同標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

1.4 大鼠一般情況觀察 放療開始后觀察大鼠飲食、體質(zhì)量的變化及放療區(qū)皮膚、毛發(fā)的變化;每次麻醉后觀察口腔黏膜，尤其是右側(cè)頰部黏膜的變化，注意有無放射性口腔黏膜炎等情況。標(biāo)本切取時(shí)觀察右側(cè)腮腺腺體形態(tài)、顏色、質(zhì)地、有無粘連等。

1.5 大鼠腮腺大體標(biāo)本觀察 放射結(jié)束后第28天，大鼠麻醉后，用剪刀沿右側(cè)耳后直線剪開，于耳后咬肌上端表面見右側(cè)腮腺，觀察腺體形態(tài)顏色、質(zhì)地、有無粘連等，之后將腮腺完整取下，置于中性甲醛溶液固定，石蠟包埋制備，切片后以HE染色。

1.6 大鼠腮腺組織病理學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下觀察兩組大鼠腮腺組織內(nèi)腺小葉結(jié)構(gòu)、腺泡結(jié)構(gòu)、小葉間導(dǎo)管結(jié)構(gòu)及腮腺組織內(nèi)血管結(jié)構(gòu)等變化。

1.7 大鼠腮腺毛細(xì)血管密度定量分析 將腮腺組織片置于倒置顯微鏡及顯微成像系統(tǒng)，組織片在200倍視野下，隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行毛細(xì)血管計(jì)數(shù)。

1.8 大鼠唾液量觀察 大鼠經(jīng)放療后收集15 min內(nèi)右側(cè)腮腺唾液分泌量的差異(采用微型Lash ley吸盤法［2］)。Wistar大鼠麻醉后仰臥位固定于自制手術(shù)臺(tái)上，大鼠吸氣時(shí)迅速將塑料導(dǎo)管插入氣管。用一小棉球擦干右側(cè)的頰黏膜，將微型Lash ley吸盤置于右側(cè)頰黏膜腮腺導(dǎo)管開口處。頸部皮下注射0.2%毛果蕓香堿(2 mg/kg)，大約3 min左右，唾液開始分泌，棄掉開始幾滴唾液，將唾液收集在已稱重的Eppendorf管內(nèi)。在收集唾液的過程中應(yīng)保持鼠的頭部合適位置避免發(fā)生窒息。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠一般情況比較 實(shí)驗(yàn)組:實(shí)驗(yàn)過程中腮腺照射區(qū)，無紅腫、破潰等淺表組織灼傷的表現(xiàn)，口腔內(nèi)頰部黏膜未出現(xiàn)充血、紅斑、潰瘍，亦無開口困難、進(jìn)食明顯減少等口腔功能明顯受損表現(xiàn)。僅在后期即累積劑量達(dá)到30 Gy后有輕度局部脫毛現(xiàn)象。至40 Gy直線加速器照射后28 d，未出現(xiàn)皮膚黏膜破損，亦未出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物死亡、提尾旋轉(zhuǎn)，狂躁等中樞性反應(yīng)。照射開始第1周后，攝食、飲水量無明顯變化;開始第2周起，開始出現(xiàn)每日攝食、飲水量減少，但未出現(xiàn)完全拒食、拒飲。體質(zhì)量在整個(gè)照射過程中呈緩慢下降的趨勢，開始第4周，體質(zhì)量下降到最低點(diǎn)，隨后呈緩慢回升的趨勢。對照組:毛發(fā)、皮膚、口腔黏膜完整，飲食活動(dòng)無異常，體質(zhì)量變化不大。

2.2 兩組大鼠腮腺大體標(biāo)本比較 實(shí)驗(yàn)組的右側(cè)腮腺呈灰白略帶紅色，質(zhì)軟，與周圍組織無粘連，肉眼觀和對照組大鼠右側(cè)腮腺形態(tài)、大小、質(zhì)地等無明顯差異。

2.3 兩組大鼠腮腺組織病理學(xué)比較 對照組:腺體組織結(jié)構(gòu)清晰，腺葉間有薄層纖維結(jié)締組織間隔，小葉間間隙較為均勻，小葉間導(dǎo)管和血管結(jié)構(gòu)層次清晰;腺泡細(xì)胞排列緊密、有規(guī)則，胞質(zhì)豐富，淺染，核大、無皺縮。毛細(xì)胞血管內(nèi)皮不增生，內(nèi)皮細(xì)胞扁平，不向管腔內(nèi)突出。實(shí)驗(yàn)組:放療4周后腺體組織結(jié)構(gòu)疏松，小葉間隙擴(kuò)大，腺泡胞質(zhì)濃縮，染色深，核縮小，深染，腺泡分泌腔皺縮變形;小葉間導(dǎo)管和血管擴(kuò)張，增厚，毛細(xì)血管內(nèi)皮增厚，血管腫脹，周圍組織有血管內(nèi)皮增生，細(xì)胞呈胖梭型，向血管腔內(nèi)突出，間質(zhì)纖維組織增多，呈明顯纖維化，并可見片狀炎細(xì)胞浸潤，以漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主。

2.4 兩組大鼠唾液分泌量比較 實(shí)驗(yàn)組及對照組腮腺唾液分泌量分別為(2.45 ±0.25)、(147.12 ±23.38)mL，兩組比較，P ＜0.05。

2.5 兩組毛細(xì)血管密度比較 分別是實(shí)驗(yàn)組及對照組毛細(xì)血管密度分別為(77.6 ±9.04)、(41.7 ±11.19)個(gè)/視野，兩組比較，P ＜0.05。

3 討論

動(dòng)物模型的建立應(yīng)遵循與人類疾病的相似性、重復(fù)性、可靠性、適用性、可控性、易行性等原則［3～6］。為了盡可能接近于臨床，以便更好地模擬臨床頭頸部放射治療時(shí)的損傷狀況，為相關(guān)研究提供穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。我們考慮制備放射性腮腺損傷模型應(yīng)滿足以下要求:①放療劑量大小適宜，放療區(qū)域接受劑量穩(wěn)定均衡;②目標(biāo)解剖區(qū)域的選擇具有特異性，便于重復(fù)操作;③適當(dāng)?shù)哪M分割，以便更好模擬臨床上分割放療的效果;④能夠形成典型的放射損傷病理改變。

3.1 放射源參數(shù)與劑量控制 為了保證目標(biāo)解剖區(qū)域的選擇具有特異性，避免鄰近重要組織器官損傷干擾實(shí)驗(yàn)效果，本實(shí)驗(yàn)中專門選用1.2 cm鉛板作為防護(hù)屏障，并在鉛板上制備4個(gè)照射孔，每孔照射視野1.6 cm×2.8 cm。經(jīng)劑量檢測:每孔中心點(diǎn)劑量差－5% ～5%，相同照射深度條件下，照射對稱性－3%～3%?？紤]放射源產(chǎn)生的射線能量不能完全達(dá)到能量均衡的要求，我們加用凝膠組織補(bǔ)償墊厚0.5 cm，以濾過低能射線，減輕皮膚等淺表組織的過度損傷，同時(shí)提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受射線能量的均衡度。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中未出現(xiàn)放療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物明顯的飲食、自主活動(dòng)等異常改變，也說明劑量的選取和控制合理。

3.2 分割治療與麻醉的矛盾 目前，臨床上頭頸部腫瘤的放射治療將總劑量進(jìn)行分割多次治療，因此為了模擬臨床治療過程，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦應(yīng)進(jìn)行分次照射，但是多次照射就意味著多次麻醉，研究［7～9］認(rèn)為多次麻醉易造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。本預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用40 Gy分割為10次照射時(shí)出現(xiàn)部分動(dòng)物在后期麻醉后未能蘇醒，正式實(shí)驗(yàn)時(shí)方案調(diào)整為8次照射，并加強(qiáng)麻醉后的觀察和護(hù)理(包括適宜穩(wěn)定的室溫、適當(dāng)?shù)捏w位以保持呼吸通暢、較低的飼養(yǎng)密度減少復(fù)蘇過程中的擠壓踩踏以及充足的水和飼料)，實(shí)驗(yàn)過程中未出現(xiàn)動(dòng)物因麻醉而死亡。

3.3 觀察時(shí)間的選擇 以往放療動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)均采用放療后較短時(shí)間內(nèi)處死動(dòng)物進(jìn)行相關(guān)檢測，所得結(jié)果主要說明放療后早期的病理改變情況，對于能否形成穩(wěn)定的中后期放射損傷改變?nèi)狈ψ銐虻恼f服力。本研究觀察窗選在放射處理達(dá)到目標(biāo)劑量后4周，此時(shí)的病理改變與目的改變相符更能說明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c臨床治療過程的一致性。

3.4 照射劑量—效應(yīng)關(guān)系 短時(shí)間內(nèi)大劑量單側(cè)唾液腺照射，分割劑量5 Gy，3次/周，20 Gy腮腺分泌下降，40 Gy腮腺功能基本喪失。本實(shí)驗(yàn)中采用40 Gy分割為8次照射，腮腺分泌量明顯減低。

3.5 病理改變 本實(shí)驗(yàn)中放療4周后腺體組織結(jié)構(gòu)疏松，小葉間隙擴(kuò)大;間質(zhì)纖維組織增多，呈明顯纖維化，并可見片狀炎細(xì)胞浸潤;說明放射線照射下大鼠腮腺間質(zhì)出現(xiàn)了明顯退行性改變。腺泡胞質(zhì)濃縮，染色深，核縮小，深染;腺泡分泌腔皺縮變形;說明放療損傷導(dǎo)致了腺泡細(xì)胞的受損，其代謝活力明顯減弱。腮腺內(nèi)血管擴(kuò)張，毛細(xì)血管內(nèi)皮增厚，血管腫脹;血管內(nèi)皮增生，細(xì)胞呈胖梭型，向血管腔內(nèi)突出;說明腮腺區(qū)放療損傷造成了腮腺內(nèi)血管的管腔變小，影響了組織有效灌注，減少了氧和營養(yǎng)的供給。毛細(xì)血管的數(shù)較正常組織明顯少，意味著放射損傷影響了新生血管的形成，組織的代謝和修復(fù)能力減弱。通過以上病理改變可以說明實(shí)驗(yàn)組的腮腺已存在較為典型的放療損傷表現(xiàn)［5，6，10～12］。上述證據(jù)表明，我們的實(shí)驗(yàn)通過模擬分割照射，選擇合適的吸收劑量及照射野，較好地模擬放射性腮腺損傷過程，造成了典型的放射損傷，并且劑量準(zhǔn)確、控制條件準(zhǔn)確、可重復(fù)性強(qiáng)，可作為放射損傷與修復(fù)相關(guān)研究的模型，為研究放射性腮腺損傷的發(fā)病機(jī)理及治療提供了基礎(chǔ)。

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