簡述豬藍(lán)耳?。≒RRS）的診斷技術(shù)

黎先偉 譯

迄今為止，無論花費(fèi)了多大的成本和努力，我們?nèi)詻]有建立一套有效的預(yù)防、控制和清除豬繁殖與呼吸綜合征（藍(lán)耳病，PRRS）的策略。不過，對(duì)我們獸醫(yī)工作者來說，掌握最佳的診斷方法來準(zhǔn)確的提前預(yù)判豬場藍(lán)耳病穩(wěn)定與否是非常重要的。目前，有什么工具和/或手段來協(xié)助我們呢？下面我們將一一闡述。

豬繁殖與呼吸綜合征是一種病毒性、災(zāi)難性的傳染病。其臨床表現(xiàn)為母豬嚴(yán)重的繁殖障礙、斷奶仔豬普遍發(fā)生肺炎、生長遲緩以及死亡率增加等癥狀。豬藍(lán)耳病是一個(gè)全球性的問題，對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)和經(jīng)濟(jì)造成非常重要的影響。單單在美國，每年由于豬藍(lán)耳病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)所造成的損失估計(jì)可達(dá)到6.64億美元。

為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，研發(fā)和實(shí)施一種可靠的、準(zhǔn)確的和及時(shí)的診斷措施是有效防控豬藍(lán)耳病的一個(gè)重要組成部分。隨著診斷技術(shù)的日益發(fā)展，對(duì)于獸醫(yī)和養(yǎng)豬業(yè)的利益相關(guān)者來說，繼續(xù)采取最佳的措施以協(xié)調(diào)應(yīng)對(duì)疾病的發(fā)展，從而保持整個(gè)行業(yè)的穩(wěn)定是非常重要的。

一、選擇合適的診斷方法

選擇一種合適的豬藍(lán)耳病診斷方法最為關(guān)鍵的第一步是，確定實(shí)施檢測的目標(biāo)。這些目標(biāo)可能包括在一個(gè)群體中檢測出至少一頭受感染的動(dòng)物；判斷病毒在群體中的流行情況；確定分離的是野毒還是疫苗毒，或評(píng)估感染的時(shí)間。這些因素將取決于待檢測的動(dòng)物、需求樣品的數(shù)量以及合適組織的使用。此外，個(gè)別動(dòng)物的檢測結(jié)果可能不能很好的反應(yīng)整個(gè)群體的狀態(tài)，因?yàn)槊總€(gè)動(dòng)物感染的狀態(tài)都有所差異，所以我們?cè)诜治鼋Y(jié)果時(shí)必須多加注意。

二、選擇合適的樣本數(shù)

當(dāng)選擇合適的用于診斷豬藍(lán)耳病的樣本數(shù)時(shí)，需要考慮到多種因素。為了從一個(gè)群體中鑒定出至少一份陽性樣本，需要考慮的因素包括群體大小、群體內(nèi)疾病的預(yù)期流行率、所需確定性的程度，以及所采用的檢測方法的敏感性和特異性。

檢測的時(shí)機(jī)也是非常重要的，因?yàn)楦腥竞兔庖叻磻?yīng)的多種方面，包括病毒血癥、病毒釋放、抗體應(yīng)答和特征性病變僅會(huì)在特定的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)。

三、選擇合適的組織樣本

一般來說，診斷檢測大體分為兩類：病毒（抗原）檢測和病毒抗體檢測。病毒（抗原）檢測需要采集富含病毒的組織、支氣管肺泡灌洗液（BALF）、胸腔液、精液、血液、唾液或環(huán)境樣本；而病毒抗體檢測則需要采集血液（血清）、唾液或肌肉滲出液等，以檢測抗藍(lán)耳病抗體的水平。因此，組織樣本的選擇取決于多種不同的因素，包括特定的檢測目的、所選擇的診斷方法和可用的設(shè)備。

四、診斷方法

自從發(fā)現(xiàn)豬藍(lán)耳病以來，人們已采用過各種不同的技術(shù)和/或方法來檢測豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）及其抗體，目前其中一些診斷技術(shù)和/或方法很少用于臨床診斷，這有多方面的原因：首先可能是這種方法更適用于實(shí)驗(yàn)室；第二該方法需要耗費(fèi)過長的時(shí)間；第三成本昂貴或需要專業(yè)培訓(xùn)過的人員等等。在下本中，我們將簡要描述現(xiàn)在針對(duì)豬藍(lán)耳病主要采用的檢測技術(shù)，同時(shí)談及一些較為傳統(tǒng)的方法以闡明近幾年來診斷技術(shù)和/或方法已發(fā)展到什么程度。

五、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的檢測

病毒的檢測技術(shù)可對(duì)疾病感染的狀態(tài)作出一個(gè)很好的指示，不過這些技術(shù)和/方法往往主要作為實(shí)驗(yàn)室研究的工具，因?yàn)樗鼈兊牟僮餍枰?jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員、而且成本較高以及所需的時(shí)間較長。一旦從樣本中分離到病毒，可使用特定的細(xì)胞系通過一系列的感染和復(fù)制從組織樣本中擴(kuò)增病毒。另一種方法就是采用電子顯微鏡直接觀察病毒，不需要通過特定分子或抗體來識(shí)別病毒，這在描繪新病毒株方面具有重要的作用。目前，新型、快速和低成本的診斷技術(shù)（見下文描述）已被廣泛使用，這些技術(shù)對(duì)于常規(guī)和快速診斷具有更高的實(shí)用性和便捷性。

1.反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。當(dāng)懷疑病毒具有垂直傳播的特性時(shí)，可選擇胎兒樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)。該方法可用于快速的、特異的和高度敏感的從不同的組織（包括血清、精液、唾液、肺組織、淋巴結(jié)、脾臟和扁桃體）和環(huán)境樣本中檢測豬藍(lán)耳病病毒。這個(gè)方法的主要步驟包括從組織樣本中抽提病毒RNA；RNA通過逆轉(zhuǎn)錄為DNA；DNA的PCR擴(kuò)增以及擴(kuò)增DNA的檢測。

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的缺點(diǎn)是組織樣本之間和動(dòng)物之間感染后病毒的檢測會(huì)有差異。此外，RTPCR的高度敏感性可能會(huì)由于樣本受污染而出現(xiàn)假陽性，而特定的引物對(duì)一些容易變異的病毒往往容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

2.免疫組化（IHC）。免疫組化方法可用于從不同部位的組織（包括肺臟、淋巴結(jié)、胸腺、扁桃體、脾臟和腎臟）中檢測豬藍(lán)耳病病毒。簡單來說，先用福爾馬林固定組織樣本，隨后用針對(duì)病毒核衣殼的單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記。最后采用一種經(jīng)標(biāo)記的第二抗體通過顯微鏡直接觀察組織中是否存在病毒。雖然免疫組化具有高度的特異性（100%），但是其僅有中等的敏感性（67%）。不過，在固定的48h內(nèi)處理組織可有效改善免疫組化的敏感性。在感染早期，敏感性的程度是最高的；而在感染后期階段，敏感性的程度會(huì)逐漸下降，如感染后超過28d，更不用說感染后超過90d。雖然免疫組化可有效鑒別仔豬中垂直傳播的病毒，但是對(duì)于一些容易變異的病毒，這種方法往往難以達(dá)到理想的效果。

3.熒光抗體染色法（FA）。熒光抗體染色法，通常用于評(píng)估支氣管肺泡灌洗液（BALF）或新鮮/冰凍的肺組織的病毒感染情況，不過目前該方法臨床上較少使用。在該技術(shù)中，樣本直接用熒光抗體進(jìn)行標(biāo)記來觀察病毒粒子。對(duì)于檢測豬藍(lán)耳病病毒來說，這種方法要比免疫組化法更為快捷和便宜，但是與免疫組化相比，熒光抗體染色法不能檢測病毒株的遺傳多樣性，而且不推薦在感染后期使用這種方法。此外，熒光抗體染色可能也存在假陽性的問題，這可能是由于原始抗體或高背景染色的特異性較差所造成的。

4.臨床試紙條檢測。試紙條檢測在豬藍(lán)耳病病毒的診斷中是一種比較新的技術(shù)，盡管尚未得到廣泛的應(yīng)用，但是這種方法可快速、便捷的檢測出豬藍(lán)耳病病毒，而不需要專業(yè)的知識(shí)或設(shè)備。試紙條通過免疫層析法檢測血清或組織勻漿中的病毒。簡單來說，這種方法的原理是樣本中的病毒與針對(duì)豬藍(lán)耳病病毒特定蛋白的金標(biāo)單克隆抗體相混合，形成蛋白-抗體復(fù)合物聚集在試紙條內(nèi)。隨后用一種經(jīng)標(biāo)記的第二抗體檢測聚集的蛋白-抗體復(fù)合物。目前，這種方法暫時(shí)只適用于有限的病毒。

六、豬藍(lán)耳病病毒特異性抗體的檢測

血清中豬藍(lán)耳病病毒特異性抗體的檢測是診斷豬藍(lán)耳病最為常用的方法，此外，也可以用唾液樣本或肌肉滲出液來進(jìn)行檢測。在美國，自從2010年以來，采用唾液樣本來診斷豬藍(lán)耳病的比例大幅增加。

豬藍(lán)耳病病毒抗體的檢測是一個(gè)不斷發(fā)展的診斷學(xué)科。一些方法和/或技術(shù)與時(shí)間和資源問題有關(guān)，目前主要用于實(shí)驗(yàn)室研究。這些方法和/或技術(shù)包括免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)法（IPMA），一種高度特異且敏感的方法，而且是首次報(bào)道用于豬藍(lán)耳病診斷的血清學(xué)方法。在這個(gè)試驗(yàn)中，經(jīng)過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體檢測的受病毒感染的細(xì)胞中的抗豬藍(lán)耳病病毒抗體富集于微孔板內(nèi)。隨后通過光學(xué)顯微鏡來評(píng)估陽性樣本。同樣，病毒中和（VN）會(huì)產(chǎn)生難以解釋的結(jié)果。

雖然抗體檢測可鑒定出新的豬藍(lán)耳病病毒感染，但是這不適于監(jiān)測以往受過感染的群體，因?yàn)檫@種方法無法區(qū)別這些是新感染、舊感染還是接種疫苗所產(chǎn)生的抗體。

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是檢測豬藍(lán)耳病病毒抗體中最為常用的一種方法。2010年愛荷華州立大學(xué)的研究已證實(shí)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的特異性可高達(dá)99.9%，敏感性也能達(dá)到98.8%。微孔表面覆蓋大量的豬藍(lán)耳病病毒融合（N）蛋白用來捕獲組織樣本中的抗豬藍(lán)耳病病毒抗體，隨后用過氧化物酶標(biāo)記的抗體顯示捕獲的抗豬藍(lán)耳病病毒。

雖然酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)既快捷又方便，但這種方法也有其局限性。免疫反應(yīng)在動(dòng)物和檢測抗體的水平之間通常是可變的，這不一定能反映病毒的毒力。此外，母源抗體和飼料中的抗體可能也會(huì)影響最終的結(jié)果。早期感染期間的可能會(huì)出現(xiàn)假陰性也是需要關(guān)注的一個(gè)問題。

2.熒光微球免疫分析法（FMIA）。熒光微球免疫分析法是一種多重版的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，即采用不同的染色熒光微球來捕獲多種抗豬藍(lán)耳病病毒抗體，隨后用熒光標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行標(biāo)記。這種技術(shù)可在單一的小樣本中同時(shí)檢測幾種不同的抗體。研究結(jié)果證實(shí)，熒光微球免疫分析法對(duì)血清樣本的敏感性和特異性分別可達(dá)到98%和95%。此外，眾所周知傳統(tǒng)的方法用于檢測唾液樣本的敏感性較低，但采用FMIA的敏感性和特異性則分別可達(dá)到92%和95%。而且對(duì)于早期感染的檢測，F(xiàn)MIA要比ELISA具有更高的敏感性。

3.間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）。

間接免疫熒光試驗(yàn)與免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)法相似，不同的是使用熒光標(biāo)記的第二抗體來檢測捕獲的抗豬藍(lán)耳病病毒抗體。研究已表明，間接免疫熒光試驗(yàn)具有較高的特異性，而敏感性則取決于多種不同的因素，包括用于捕獲抗體的細(xì)胞類型、實(shí)驗(yàn)室條件和抗豬藍(lán)耳病病毒的抗原性。通常情況下，樣本進(jìn)行ELISA檢測之后再進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)以排除假陽性的結(jié)果。此外，這種方法也可采用唾液和肌肉滲出液樣本來進(jìn)行試驗(yàn)。

4.臨床試紙條檢測。試紙條檢測技術(shù)除了可用于檢測病毒抗原以外，現(xiàn)在這種方法也可用于檢測豬藍(lán)耳病病毒抗體（采用病毒融合蛋白）。膠體金試紙條技術(shù)不僅低成本、快捷和方便使用，而且不需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。據(jù)報(bào)告，這種方法的敏感性和特異性分別可達(dá)到93%和98%。不過，這種方法還沒有被廣泛使用。

七、病毒分離株的特性

病毒分離株的特性對(duì)于管理者及時(shí)做出正確的決策來說往往是非常重要的，如決定是否需要把養(yǎng)殖場內(nèi)的動(dòng)物轉(zhuǎn)移到另一個(gè)區(qū)域、跟蹤病毒的蔓延趨勢以及確定是否新的病毒株存在于豬群內(nèi)。分子生物學(xué)技術(shù)，包括RFLP和DNA序列分析要比傳統(tǒng)方法更準(zhǔn)確的分析豬藍(lán)耳病病毒的特異性。

八、序列分析

目前，病毒基因組的序列分析是鑒定豬藍(lán)耳病病毒最常選擇的方法。從血清和受感染組織的樣本中提取的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，這可為病毒株的分析提供最可靠的數(shù)據(jù)。ORF5序列的高變區(qū)用于區(qū)分病毒株是最為可靠的，而且ORF5的全基因序列也常用于分析比對(duì)不同的病毒。不同病毒株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系可通過繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹來表示。這可有效反應(yīng)養(yǎng)殖場群體的感染水平，以監(jiān)測當(dāng)?shù)厝后w內(nèi)病毒株的變異情況。當(dāng)在群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)潛在的新變異病毒時(shí)必須引起高度重視。

九、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）診斷的未來

要想成功的從豬群中控制和清除豬藍(lán)耳病病毒的感染，我們需要采用常規(guī)監(jiān)測和疾病診斷相結(jié)合的方法。雖然一系列的診斷技術(shù)已有效地成為診斷豬藍(lán)耳病病毒的手段，但是對(duì)于所有的情況和動(dòng)物，目前仍沒有一種檢測技術(shù)是100%可靠的。隨著新技術(shù)的不斷引入，人們?nèi)找嬉蟠_保在合適的時(shí)間點(diǎn)對(duì)合適的動(dòng)物進(jìn)行合適的檢測，并采用合理的干預(yù)來優(yōu)化有效的管理措施，從而最大化的預(yù)防或控制疾病的暴發(fā)。（By Olivier Duran）