鹿等反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系及研究技術(shù)進(jìn)展

■ 劉國興 張 輝 叢立新

（1.長白山動(dòng)植物資源利用與保護(hù)吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省吉林市132101；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林省吉林市132101）

反芻動(dòng)物瘤胃因其在高效降解木質(zhì)纖維素上的特殊地位，而成為動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)者的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象，特別是隨著世界能源危機(jī)的出現(xiàn)，瘤胃微生物資源的開發(fā)和利用已成為目前的一項(xiàng)緊迫的工作。鹿的瘤胃微生物未受現(xiàn)代工業(yè)和生活污染，發(fā)掘和利用鹿瘤胃微生物資源顯得尤為重要。本文對(duì)有關(guān)鹿等反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系的研究及研究技術(shù)進(jìn)行概述，為研究和開發(fā)鹿的瘤胃微生物資源提供依據(jù)。

1 傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)研究

20世紀(jì)以前瘤胃微生物研究最主要依賴于傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)。利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)北海道野生梅花鹿的瘤胃發(fā)酵特性顯著受季節(jié)的影響。瘤胃液pH值冬季高于秋季和夏季，說明夏秋兩季瘤胃中VFAs濃度高于冬季。乙酸的濃度冬季時(shí)升高，說明鹿的瘤胃微生物主要依靠產(chǎn)乙酸菌發(fā)酵以適應(yīng)冬季的高纖維日糧。夏、秋兩季瘤胃內(nèi)丙酸濃度升高，說明鹿瘤胃微生物利用了可發(fā)酵的碳水化合物；同時(shí)氨態(tài)氮的濃度較高，說明鹿的日糧中可利用的蛋白水平較高，且瘤胃中蛋白質(zhì)降解菌的數(shù)量增多。秋季和冬季梅花鹿瘤胃原蟲數(shù)量比夏季分別減少28%和10%。冬季梅花鹿瘤胃細(xì)菌的數(shù)量顯著低于秋季，革蘭氏陰性球菌的比例顯著增大，而革蘭氏陰性桿菌的數(shù)量顯著減少。北海道地區(qū)野生梅花鹿瘤胃細(xì)菌多樣性研究表明，梅花鹿瘤胃中大部分細(xì)菌屬于CFB的未培養(yǎng)細(xì)菌。且在冬季日糧條件較差時(shí)，其瘤胃內(nèi)Streptococcus spp和Ruminococcus spp數(shù)量增加[1]。斯瓦爾巴德群島馴鹿冬季盲腸占整個(gè)消化道體積的7%，夏季時(shí)為11%，且瘤胃內(nèi)乙酸與丙酸值冬季顯著低于夏季。從夏季到冬季瘤胃內(nèi)原蟲種類無變化，但總數(shù)從105減少為104，細(xì)菌總數(shù)減少10%～50%左右，降解纖維的細(xì)菌比例由15%增到35%。淀粉降解菌的數(shù)量夏季為冬季時(shí)數(shù)量的6倍多[2]。李光玉等（1998）研究得出鹿科動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系具有顯著的季節(jié)效應(yīng)，原蟲數(shù)量夏季極顯著地高于其他季節(jié)（P＜0.01），冬、春兩季顯著高于秋季（P＜0.05）。

Aagnes等(1995)對(duì)冬季挪威馴鹿在不同飼養(yǎng)條件下瘤胃發(fā)酵特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，馴鹿放牧飼養(yǎng)時(shí)瘤胃液相中主要細(xì)菌有Bacteroides spp、Fibrobacter spp和Clostridium spp；飼喂青苔時(shí)主要細(xì)菌為Streptococcus spp和Clostridium spp，饑餓時(shí)優(yōu)勢細(xì)菌為Fusobacteri?um spp和Eubacterium spp，青苔表面黏附時(shí)主要細(xì)菌為Bacteroides spp。半家養(yǎng)的成年雌性挪威馴鹿采食牧草的夏季，瘤胃內(nèi)細(xì)菌、產(chǎn)甲烷菌和纖毛蟲的數(shù)量分別為 5.17×1011、3.17×109和 4.02×107。Methanobrevi?bacter spp和未培養(yǎng)古菌為優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌[3]。Sundset等(2007)發(fā)現(xiàn)，斯瓦爾巴德群島秋冬季節(jié)采食牧草的馴鹿瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量秋季時(shí)增加，Methanoplasma?tales為產(chǎn)甲烷菌的優(yōu)勢菌，與采食精料時(shí)瘤胃內(nèi)的細(xì)菌區(qū)系不同。放牧?xí)r其優(yōu)勢菌群為梭菌目（70.6%）和擬桿菌目（29.4%），而采食精料時(shí)優(yōu)勢菌群為Clostridi?um spp（91.1%）。Sundset等（2008）在挪威馴鹿瘤胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)了耐受地衣酸，而且可在含有地衣酸的培養(yǎng)基中生長的 Eubacterium rangiferina。Hiura等（2010）從北海道地區(qū)野生梅花鹿瘤胃內(nèi)分離到可將水解單寧降解為沒食子酸的Streptococcus macedonicus[4]。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法缺點(diǎn)是耗時(shí)費(fèi)力，對(duì)操作技術(shù)要求高，尤其是對(duì)嚴(yán)格厭氧的微生物難以操作，其分離培養(yǎng)的種類僅占瘤胃微生物群體的10%～20%。近年來，研究者們經(jīng)過培養(yǎng)條件優(yōu)化分離到許多以前未曾培養(yǎng)過的細(xì)菌種類。因此，分離培養(yǎng)技術(shù)在一定歷史時(shí)期還將是發(fā)現(xiàn)鹿瘤胃新的微生物的一種重要途徑[5]。

2 分子生物學(xué)技術(shù)研究

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系的研究。通過提取瘤胃微生物基因組DNA，PCR擴(kuò)增特定區(qū)域、再進(jìn)行序列測定等途徑即可獲取瘤胃微生物的群體信息。李志鵬（2014）采用反復(fù)凍融-CTAB/SDS/蛋白酶K法與溶菌酶兩種方法提取梅花鹿瘤胃微生物基因組DNA，反復(fù)凍融法比溶菌酶法更加快捷[6]。非培養(yǎng)技術(shù)有以下研究技術(shù)方法。

2.1 16S/18S rRNA基因克隆文庫技術(shù)

小rRNA因具有高度的保守序列而成為理想的靶基因序列，尤其適合于進(jìn)化不同的微生物的親緣關(guān)系的研究。這種方法是提取瘤胃微生物的基因組DNA并以其為模板，用特定區(qū)域序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建rRNA基因的克隆文庫，將其同源性達(dá)到97%的計(jì)為一個(gè)（Optical Transform Unit，OTU），每一個(gè) OTU 即代表一種微生物，根據(jù)OTU的數(shù)量即可推出瘤胃微生物的數(shù)量，從而了解瘤胃微生物體系。

用此方法，Jarvis等（1998）在赤鹿瘤胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)了兩株細(xì)菌LIP4和 LIP5，可將中性油脂、動(dòng)物油脂和橄欖油水解為長鏈脂肪酸和甘油，LIP4可將中性、動(dòng)物性和橄欖油脂水解為以丙酸為主的長鏈脂肪酸，LIP5的水解產(chǎn)物主要為乙酸、乙醇和琥珀酸，以參照其形態(tài)特征將其歸屬于Clostridium spp XIVa和Propi?onibacterium spp。Nelson等（2003）發(fā)現(xiàn)瘤牛和斑馬瘤胃中至少 24種新細(xì)菌種或?qū)?。Deng等（2007）發(fā)現(xiàn)了大額牛瘤胃液中存在新的細(xì)菌種類。劉利等(2009)發(fā)現(xiàn)LGCGPB（56.66%）和 CFB（73.33%）是廣西水牛瘤胃內(nèi)的主要細(xì)菌；An等（2005）得出牦牛的瘤胃細(xì)菌有50%種類尚未被發(fā)現(xiàn)。Leng等認(rèn)為LGCG?PB為云南地區(qū)大額牛瘤胃優(yōu)勢細(xì)菌[7]。Pei等檢測到羊駝瘤胃內(nèi)主要的細(xì)菌是Eubacterium spp，山羊瘤胃中的主要細(xì)菌是Prevotella spp[8]。劉開朗等(2009)發(fā)現(xiàn)反芻動(dòng)物瘤胃的微生物具有種屬特異性，并受地理環(huán)境影響。與Yang等得出的牛種瘤胃中細(xì)菌組成趨于一致的結(jié)論相反，但與Shi等得出的牛瘤胃的微生物體系有種的特異性的結(jié)論一致，其原因可能是瘤胃微生物區(qū)系受日糧或地理環(huán)境影響[9]。公羊瘤胃主要有厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門3種細(xì)菌，且受日糧類型影響[10]。與Tajima等（1999）的奶牛瘤胃微生物研究結(jié)論相同；肉牛瘤胃微生物區(qū)系因日糧的組成及瘤胃的生理部位而異[11]。石鵬君等（2007）通過16S rRNA基因發(fā)現(xiàn)波爾山羊、內(nèi)蒙古絨山羊和南江黃羊瘤胃內(nèi)細(xì)菌具有一定的相似性，其程度種內(nèi)個(gè)體顯著高于種間個(gè)體，提示瘤胃細(xì)菌區(qū)系受寄主品種的影響。

李志鵬（2014）得出，鹿瘤胃的細(xì)菌主要由擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門組成，分別以柞樹葉和玉米秸稈為主要粗飼料飼喂時(shí)擬桿菌門占99.3%和85%，以后者為主要粗飼料飼喂時(shí)瘤胃中厚壁菌門和變形菌門細(xì)菌的數(shù)量也相對(duì)較高[6]。

該方法的缺點(diǎn)是同一細(xì)菌基因組內(nèi)有多個(gè)拷貝的16S rRNA基因而影響微生物區(qū)系的結(jié)果。分析結(jié)果容易受微生物基因組DNA大小、PCR擴(kuò)增引物、條件與效率的影響。

2.2 單鏈構(gòu)態(tài)多樣性分析技術(shù)

單鏈構(gòu)態(tài)多樣性分析（Single Strand Conforma?tion Polymorphism，SSCP）可將堿基組成不同，數(shù)量相同的序列分開。將16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物變性形成兩股單鏈，每個(gè)單鏈因其大小與堿基組成的差異，通過氫鍵形成不同的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致在凝膠中產(chǎn)生不同的遷移速率，即產(chǎn)生不同特征的條帶圖譜。

利用此項(xiàng)技術(shù)，Tatsuoka等（2007）對(duì)牛瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的多樣性進(jìn)行了分析；Michelland等（2003）得出牛瘤胃內(nèi)古菌群落個(gè)體間差異小且具有相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。Boguhn等觀測到不同精粗飼料組成的日糧和鐮刀霉菌毒素對(duì)瘤胃微生物的多樣性[12]。

該方法的缺點(diǎn)是雙鏈PCR產(chǎn)物有時(shí)會(huì)形成3個(gè)條帶，導(dǎo)致相似的序列之間易形成異源的雙鏈分子而導(dǎo)致分析結(jié)果的誤差。

2.3 變性梯度凝膠電泳技術(shù)

變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分析微生物的多樣性、富集培養(yǎng)物及分離細(xì)菌等。DGGE技術(shù)是在5’端引物上游加一段富含GC的約40 bp的序列，使雙鏈的DNA變性時(shí)氫鍵不完全斷裂。使得堿基組成不同的PCR產(chǎn)物在大小片段相同時(shí)進(jìn)行梯度聚丙烯酰胺凝膠時(shí)的解鏈狀態(tài)不同，導(dǎo)致停止遷移在不同的梯度凝膠位置，形成不同的條帶，在理論上一種微生物形成一個(gè)條帶，當(dāng)某種微生物數(shù)量多時(shí)，則其條帶也比較大，出現(xiàn)特異性的條帶意味著存在某類特殊的微生物（Muyzer等，1993）。

利用該技術(shù)，2001年Kocherginskaya等發(fā)現(xiàn)公牛日糧以玉米為主時(shí)，優(yōu)勢菌群為CFB，而LGCGPB是以牧草為主時(shí)的優(yōu)勢菌。馮薇等（2010）發(fā)現(xiàn)乳牛的瘤胃中青貯玉米與羊草表面黏附具有相似性的細(xì)菌組成，而苜蓿表面的細(xì)菌組成與其相差很大。姚文等（2004）觀測到山羊瘤胃中細(xì)菌存在多樣性的差異。茅慧玲等（2010）證明茶皂素和豆油一定程度地改變了羔羊瘤胃的細(xì)菌區(qū)系，但不影響細(xì)菌的多樣性。淡瑞芳等（2009）發(fā)現(xiàn)藏系綿羊的瘤胃細(xì)菌區(qū)系具有季節(jié)性的變化規(guī)律。崔振亮等發(fā)現(xiàn)牛的瘤胃細(xì)菌區(qū)系受遺傳因素品系的影響，日糧中添加青貯桑葉改變了瘤胃細(xì)菌的結(jié)構(gòu)，但對(duì)其多樣性影響不大[13]。Li等（2010）證明了牛瘤胃的上皮不同部位的細(xì)菌區(qū)系無差異，但與其內(nèi)容物中的細(xì)菌區(qū)系不同[14]。Larue等（2005）在山羊的瘤胃液相、植物表面松散黏附和緊密黏附的細(xì)菌結(jié)構(gòu)受飼料成分的影響較為顯著，使其細(xì)菌區(qū)系更為復(fù)雜。Mackie等（2003）發(fā)現(xiàn)反芻動(dòng)物幾乎都存在微生物Oscillospira spp。Zhou等（2010）發(fā)現(xiàn)牛瘤胃內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量受飼料利用率的影響，當(dāng)飼料利用率低時(shí)甲烷菌組成多，否則較低；牛瘤胃中日糧能量低時(shí)會(huì)導(dǎo)致富集較多的Methanobrevibacter ruminnatium，而日糧能量高時(shí)，Methanobrevibacter smithii增多。

李志鵬（2014）通過比較梅花鹿、荷斯坦牛、波爾山羊的瘤胃細(xì)菌結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，鹿的瘤胃中細(xì)菌數(shù)量與荷斯坦牛大致相同，而波爾山羊的瘤胃細(xì)菌較少。其中荷斯坦牛以具有降解纖維素作用的Pseudobutyrivibrio ruminis和Eubacterium ruminantium為優(yōu)勢菌。波爾山羊以Clostridium spp為優(yōu)勢菌；鹿的優(yōu)勢細(xì)菌是Prevotella spp與Succinivibrio dextrinosolvens，但當(dāng)梅花鹿采食大量的柞樹葉時(shí)會(huì)導(dǎo)致瘤胃中細(xì)菌的多樣性降低[6]。

分子指紋圖譜技術(shù)的DGGE具有快速、重復(fù)性高、信息量豐富的優(yōu)點(diǎn)，可以檢測到含量大于1%的微生物。但同一種細(xì)菌會(huì)因?yàn)橛卸鄠€(gè)拷貝的16S rRNA而形成不同DGGE條帶，且多樣性受16S rRNA基因不同變異區(qū)的影響，其分辨率只對(duì)不超過500個(gè)堿基序列有效。

2.4 T-RFLP技術(shù)研究瘤胃微生物多樣性

末端限制性片段長度多態(tài)性分析（Terminal Re?striction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）技術(shù)可用于研究環(huán)境中微生物的多樣性，也可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測微生物的變化。其原理是根據(jù)微生物比較基因組學(xué)信息，選取一段具有進(jìn)化特征的目的序列（通常為16S rRNA基因）進(jìn)行擴(kuò)增，在上游引物5′端標(biāo)記熒光物質(zhì)，限制性內(nèi)切酶可以消化熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物即可被測序儀識(shí)別，形成不同的T-RFs限制性片段峰，分別代表不同的OTU，其高度和面積體現(xiàn)微生物的相對(duì)豐度。通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫比對(duì)，即可推測其代表的微生物類別。使T-RFLP方法，Avaniss-Aghajani于1996年首次對(duì)分支桿菌進(jìn)行了鑒定；Liu等（1997）研究了白蟻消化道及污泥中微生物群落組成；Fernan?do等（2010）分析了肉牛采食粗飼料和精料時(shí)瘤胃內(nèi)細(xì)菌區(qū)系的變化，共鑒定出115種細(xì)菌，但兩種日糧條件下厚壁菌門/擬桿菌門差異不顯著；Khafipour等（2009）發(fā)現(xiàn)奶牛瘤胃中擬桿菌門細(xì)菌的數(shù)量在瘤胃酸中毒時(shí)減少；奶牛泌乳期間，瘤胃、十二指腸、空腸和糞便中的微生物多樣性具有顯著的差異[15]；山羊瘤胃的細(xì)菌數(shù)量在日糧中添加葵花油和魚油后發(fā)生了變化[16]；奶牛的瘤胃的原蟲數(shù)量不受日糧結(jié)構(gòu)的影響，但古菌區(qū)系、細(xì)菌顯著受其影響[17]。李志鵬得出Prevotella spp是梅花鹿瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢細(xì)菌，且其微生物區(qū)系顯著受粗飼料的影響，個(gè)體間的差異也較大[6]。

T-RFLP技術(shù)是以快速、分辨率高和重復(fù)性高而被廣泛采用，可直接與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中的微生物信息進(jìn)行比對(duì)；核酸的測序技術(shù)比凝膠電泳技術(shù)更準(zhǔn)確；快速性且結(jié)果以數(shù)值形式輸出（Marsh，1999），較 DGGE和SSCP來比具有更大的優(yōu)越性。但是，由于不同類型的微生物可以產(chǎn)生相同的末端片段峰而易導(dǎo)致對(duì)樣品中微生物的錯(cuò)誤估測與認(rèn)識(shí)（李獻(xiàn)梅等，2009），也不能在種水平上將微生物徹底區(qū)分，其多樣性結(jié)果會(huì)因基因組DNA的濃度、PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)和限制性內(nèi)切酶的影響使其應(yīng)用具有局限性。

2.5 高通量測序技術(shù)

高通量測序（High-Throughput Sequencing）又名下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS），是相對(duì)于傳統(tǒng)的桑格測序而言的。可以同時(shí)完成傳統(tǒng)的基因組學(xué)研究以及功能基因組學(xué)的基因表達(dá)及調(diào)控，基因功能，蛋白/核酸相互作用的研究。目前高通量測序的主要平臺(tái)代表有羅氏公司的454測序儀，Illu?mina公司的Solexa基因組分析儀和ABI的SOLiD測序儀。在原理上很多的共同之處是①將目標(biāo)DNA剪切為小片段；②單個(gè)小片段DNA分子結(jié)合到固相表面；③單分子獨(dú)立擴(kuò)增；④每次只復(fù)制一個(gè)堿基（A，C，T，G）并檢測信號(hào)；⑤高分辨率的成像系統(tǒng)。

利用這項(xiàng)技術(shù)，陳富榮通過構(gòu)建牦牛瘤胃元基因組BAC文庫，從9 600個(gè)克隆中篩選獲得60個(gè)脂肪酶的陽性克隆，123個(gè)木聚糖酶的陽性克隆，156個(gè)纖維素酶的陽性克隆，得出大量的木質(zhì)纖維素降解酶基因/基因簇存在于文庫中[18]。Pope等得出，斯瓦爾巴德群島馴鹿瘤胃微生物中以擬桿菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢細(xì)菌，可降解降解纖維素、木質(zhì)素和果膠等多種多糖[19]。

3 小結(jié)

如前所述，應(yīng)用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)梅花鹿、馴鹿及梅花鹿等鹿科動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系進(jìn)行了一定的研究，其技術(shù)方法及研究結(jié)果不僅有助于豐富瘤胃微生物資源數(shù)據(jù)庫，而且能夠?yàn)槊坊沽鑫赴l(fā)酵的優(yōu)化調(diào)控提供新思路，更能為發(fā)掘重要瘤胃微生物基因資源提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。針對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系研究的每一類方法都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法積累了大量的種群分類數(shù)據(jù)，可作為生物標(biāo)記物方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品或當(dāng)作分子工具，在功能特性的認(rèn)識(shí)上成為一種獨(dú)特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法可以完成對(duì)微生物的定性研究，現(xiàn)代分子生物學(xué)可提高解析微生物的靈敏度，在分子水平上開闊了物種的多樣性視野，基因指紋技術(shù)可對(duì)多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行分析，直觀地顯示瘤胃微生物區(qū)系的動(dòng)態(tài)變化，也可用其分析調(diào)控因子對(duì)微生物群落及其功能的影響，進(jìn)而用其指導(dǎo)瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)。反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系及其多樣性解析技術(shù)的發(fā)展趨勢是快速而靈敏、原位、高通量且準(zhǔn)確定量。