兒童雙側(cè)腎母細(xì)胞瘤差異性表達(dá)蛋白的篩選

閆澤晨，代醒，楊錦建，張俊杰，郭飛，余捷凱，鄭樹(shù)，王家祥(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南省泌尿外科研究所，鄭州45005； 鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院；浙江大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤研究所)

兒童雙側(cè)腎母細(xì)胞瘤差異性表達(dá)蛋白的篩選

閆澤晨1，代醒2，楊錦建1，張俊杰1，郭飛1，余捷凱3，鄭樹(shù)3，王家祥1(1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南省泌尿外科研究所，鄭州450052；2 鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院；3浙江大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤研究所)

摘要：目的采用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)篩選雙側(cè)腎母細(xì)胞瘤(BWT)的差異性表達(dá)蛋白。方法選取BWT患兒血清標(biāo)本10例(BWT組)，另選單側(cè)腎母細(xì)胞瘤(UWT)患兒血清標(biāo)本(UWT組)及健康兒童血清標(biāo)本(對(duì)照組)各20例，采用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)并收集相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果 應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到差異性峰10個(gè)(P<0.01)。對(duì)比各組差異性表達(dá)蛋白峰值數(shù)據(jù)，篩選出質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)(m/z)為5 648 Da的差異性表達(dá)蛋白1個(gè)，其在BWT組、UWT組及對(duì)照組中表達(dá)強(qiáng)度分別為3 889.36±1 796.83、2 886.81±1 404.65、432.21±730.42，三組相比，P均<0.01。 結(jié)論 采用SELDI-TOF-MS技術(shù)成功篩選出一種BWT差異性表達(dá)蛋白，其有望成為BWT早期診斷及預(yù)后判斷的新的標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：生物學(xué)標(biāo)記；腎母細(xì)胞瘤；蛋白質(zhì)組

腎母細(xì)胞瘤(WT)是兒童最為常見(jiàn)的一種原發(fā)性腹部實(shí)體器官惡性腫瘤，在中國(guó)發(fā)病率為2.5/100萬(wàn)。該病早期癥狀多無(wú)特異性，往往表現(xiàn)為可觸及的無(wú)癥狀腹部腫塊。其中，雙側(cè)腎母細(xì)胞瘤(BWT)發(fā)病率占所有WT的5%～7%，且5年生存率遠(yuǎn)低于單側(cè)腎母細(xì)胞瘤(UWT)患者。但目前尚無(wú)用于BWT診斷的腫瘤標(biāo)志物。蛋白質(zhì)指紋技術(shù)又稱表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)，能對(duì)不同組別生物樣本的相關(guān)性蛋白質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)情況進(jìn)行篩選，為尋找與BWT相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物提供了可能[1,2]。2009年1月～2013年12月，我們分別采集了BWT患兒、UWT患兒及健康兒童的血清樣本，并采用SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)BWT差異性表達(dá)蛋白進(jìn)行篩選[3]，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1血清樣本收集與處理于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下分別采集10例BWT患兒(BWT組)、20例UWT患兒(UWT組)和20例健康兒童(對(duì)照組)的血清樣本。BWT組男3例，女2例，年齡7～48個(gè)月，平均(34.20±12.41)個(gè)月，均經(jīng)病理證實(shí)為BWT。UWT組男6例，女4例，年齡4～56個(gè)月，平均(41.20±10.12)個(gè)月，均經(jīng)病理證實(shí)為UWT。對(duì)照組男5例，女5例，年齡4～74個(gè)月，平均(34.53±15.52)月。三組性別、年齡具有可比性。同時(shí)，根據(jù)WT的分期標(biāo)準(zhǔn)，所選取的BWT均為Ⅴ期，UWT為Ⅰ～Ⅳ期。所采集的血清樣本于室溫靜置1～2 h后，3 000 r/min離心20 min，取上清液，分裝于EP管中，于-80 ℃冰箱保存。

1.2試劑與儀器尿素(Urea)，醋酸鈉(NaNC)，1,4-二硫蘇糖醇(DTT)，甲基氰(ACN)，3-環(huán)已胺-1-丙磺酸(CHAPS)，三氟乙酸(TFA )及芥子酸(SPA)等購(gòu)于Sigma公司。精密電子天平(AT261)購(gòu)于Mettler公司。去離子純水機(jī)(Milli-Q Plus)購(gòu)于Millipore公司。雪花制冰機(jī)(YB-ZBJ-X40)購(gòu)于Ross Temp公司。冷凍高速離心機(jī)(Sorvall Stratos)、-80 ℃超低溫冰箱及微量移液器等購(gòu)自Thermo公司。PBSⅡ+型SELDI-TOF-MS分析儀及弱陽(yáng)離子交換芯片(WCX2)等購(gòu)自Ciphergen Biosystem公司。

1.3差異性表達(dá)蛋白的篩選三組血清在冰浴上緩慢融解(30～60 min)，10 000 r/min、4 ℃離心5 min，取5 μL血清，加入10 μL U9血清處理液中，4 ℃條件下?lián)u床上振蕩使其充分混合(600次/min，共振蕩30 min)；用Binding Buffer將U9處理后的血清稀釋至200 μL，4 ℃搖床上振蕩(600次/min，振蕩2 min)后于WCX2蛋白芯片上樣。先用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白芯片All-in-One將SELDI質(zhì)譜系統(tǒng)的分子量誤差校正至<0.1%，再將待測(cè)芯片放入質(zhì)譜儀中檢測(cè)[4,5]。

1.4數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Ciphergen Biosystems 3.1對(duì)所采集數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，使總離子強(qiáng)度與分子量均一化。用非抽樣離散小波轉(zhuǎn)換法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并作信號(hào)降噪處理。根據(jù)標(biāo)記好的出現(xiàn)在所有選定光譜中的3個(gè)峰值，調(diào)整信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)記。采用對(duì)齊單調(diào)的最小曲線和質(zhì)量校正的方法對(duì)光譜進(jìn)行基線校正。過(guò)濾信噪比(S/N)>2的峰值。聚類(lèi)分析的最小閾值設(shè)定為10%，并將各個(gè)樣本中質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)(m/z)差異<0.3%的峰值聚為同一類(lèi)[6]。對(duì)找出的峰值在各個(gè)樣本中的強(qiáng)度作均一化處理。將集內(nèi)最大高度作為降值，代表蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾噪音及聚類(lèi)分析處理后，對(duì)篩選出的m/z峰值進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)兩兩比較采用進(jìn)行t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0．01。

2結(jié)果

經(jīng)SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)各組血清樣本進(jìn)行篩選，得到一系列蛋白質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度數(shù)據(jù)。再將BWT組、UWT組及對(duì)照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，篩選出差異性表達(dá)蛋白m/z的峰值。其中，BWT組與對(duì)照組中篩選出差異性蛋白峰值14個(gè)，其中8個(gè)在BWT組中高表達(dá)，4個(gè)在對(duì)照組中高表達(dá)；BWT組與UWT組篩選出差異性蛋白峰值10個(gè)，其中8個(gè)在BWT組中高表達(dá)，2個(gè)在UWT組中高表達(dá)；UWT組與對(duì)照組中篩選出差異性蛋白峰值13個(gè)，其中11個(gè)在BWT組中高表達(dá)，2個(gè)在對(duì)照組中高表達(dá)。對(duì)比各組差異性表達(dá)蛋白峰值數(shù)據(jù)，篩選出一種m/z 為5 648 Da的蛋白，其在BWT組、UWT組及對(duì)照組中的表達(dá)強(qiáng)度分別為3 889.36±1 796.83、2 886.81±1 404.65、432.21±730.42，三組相比，P均<0.01。

3討論

WT又稱為腎胚胎瘤，多發(fā)于兒童，50%的患兒于5歲前發(fā)病。該病早期無(wú)明顯癥狀，多為父母為患兒洗澡或穿衣時(shí)被發(fā)現(xiàn)。BWT極為少見(jiàn)，其診斷與治療均較UWT復(fù)雜。根據(jù)兒童腫瘤組織基于外科和組織病理學(xué)制定的WT分期標(biāo)準(zhǔn)，BWT屬于Ⅴ期，其預(yù)后相對(duì)較差。雖然近年來(lái)超聲、CT及MRI等影像學(xué)檢查技術(shù)不斷發(fā)展成熟，BWT的檢出率也越來(lái)越高，然而對(duì)于一側(cè)腫瘤直徑<1.0 cm的BWT仍有一定的漏診率[7]。BWT患兒早期確診后行術(shù)前化療有利于腫瘤切除，并可減少術(shù)中腫瘤破潰率及術(shù)后并發(fā)癥。但目前針對(duì)BWT尚無(wú)一種高特異性的腫瘤標(biāo)志物。因此，篩查BWT差異性表達(dá)蛋白對(duì)于提高BWT早期確診率、減少漏診及預(yù)后判斷非常重要[8]。

蛋白質(zhì)組學(xué)的概念由澳大利亞學(xué)者M(jìn)arc Wilkins于1994年率先提出，指基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)及其存在方式。蛋白質(zhì)組學(xué)方法旨在蛋白質(zhì)水平上對(duì)細(xì)胞或機(jī)體基因表達(dá)的終產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量研究，從而揭示生命活動(dòng)規(guī)律及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制[9]。SELDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合了芯片微陣列與質(zhì)譜技術(shù)兩者的優(yōu)點(diǎn)，其將傳統(tǒng)基質(zhì)改為以色譜原理設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)芯片，增強(qiáng)了其分離能力；芯片表面利用親和力來(lái)捕獲蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)等信息[2]；利用激光脈沖輻射解吸芯片中的待測(cè)樣本，形成荷電離子，后根據(jù)不同的質(zhì)荷比及離子在儀器場(chǎng)中飛行時(shí)間不同來(lái)繪制質(zhì)譜圖，能檢測(cè)出樣品中各種蛋白質(zhì)的分子量及表達(dá)水平。近年來(lái)，SELDI-TOF-MS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤、心腦血管疾病及免疫系統(tǒng)疾病等多種疾病的研究，同時(shí)也被認(rèn)為是腫瘤早期標(biāo)志物檢測(cè)方面最有發(fā)展前景的一項(xiàng)技術(shù)[10]。該技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展為我們尋找WT，尤其是BWT的差異性表達(dá)蛋白提供了新的思路與方法。

我們采用SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)BWT組、UWT組及對(duì)照組血清蛋白進(jìn)行篩選，得到m/z 為5 648 Da的差異性表達(dá)蛋白在BWT組、UWT組及對(duì)照組中的蛋白表達(dá)強(qiáng)度分別為3 889.36±1 796.83、2 886.81±1 404.65及432.21±730.42，三組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前認(rèn)為，組織病理學(xué)特征與分期是影響WT患兒預(yù)后的最主要因素。本研究中BWT患兒均屬于Ⅴ期，而UWT患兒為Ⅰ～Ⅳ期。BWT組m/z 為5 648 Da的蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯高于UWT組，與腫瘤分期有一定聯(lián)系。且UWT組、BWT組m/z 為5 648 Da的蛋白表達(dá)強(qiáng)度均高于對(duì)照組，這說(shuō)明該差異性表達(dá)蛋白在WT，尤其是BWT的生長(zhǎng)與分化中可能起到一定的作用，有助于BWT的診斷及預(yù)后評(píng)估。

總之，本研究成功篩選出了一種在BWT與UWT、健康兒童之間差異性表達(dá)的蛋白，為后續(xù)差異性表達(dá)蛋白的鑒定及BWT的靶向治療等相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)，同時(shí)其有望成為早期診斷BWT及判斷預(yù)后的新的標(biāo)志物[11,12]。然而由于BWT發(fā)病率低，本研究納入樣本量相對(duì)較少，故該差異性表達(dá)蛋白的可靠性有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1] Simsek C, Sonmez O, Keyf AI，et al．Importance of serum SELDI-TOF-MSanalysis in the diagnosis of early lung cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013,14(3):2037-42.

[2] Bozdayi AM, Karatayli SC, Alag?z SG，et al． Potential proteomic biomarkers inassessing liver fibrosis using SELDI-TOF MS[J]. Turk J Gastroenterol, 2012,23(1):46-53.

[3] 黃澄如,孫寧,張濰平,等. 雙側(cè)腎母細(xì)胞瘤的診治——附11例報(bào)告[J].中華小兒外科雜志,2012,33(3):161-164.

[4] Smerdel-Ramoya A, Zanotti S, Canalis E. Nephroblastoma overexpressed (Nov)induces gremlin in ST-2 stromal cell lines by post-transcriptional mechanisms[J]. J Cell Biochem, 2011,112(2):715-722.

[5] 張建軍,宋興華,謝紀(jì)寶,等. 應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)大鼠急性脊髓損傷后腦脊液蛋白組學(xué)的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2011,28(5):820.

[6] Zhang Q, Wang J, Dong R，et al． Identification of novel serum biomarkers in child nephroblastoma using proteomics technology[J]. Mol Biol Rep, 2011,38(1):631-638.

[7] Canalis E, Smerdel-Ramoya A, Durant D, et al．Nephroblastoma overexpressed (Nov) inactivation sensitizes osteoblasts to bonemorphogenetic protein-2, but nov is dispensable for skeletal homeostasis[J].Endocrinology, 2010,151(1):221-233.

[8] Doghman M, Arhatte M, Thibout H, et al. Nephroblastoma overexpressed/cysteine-rich protein 61/connectivetissue growth factor/nephroblastoma overexpressed gene-3 (NOV/CCN3), a selective adrenocortical cell proapoptotic factor, is down-regulated in childhoodadrenocortical tumors[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2007,92(8):3253-3260.

[9] Couttas TA, Raftery MJ, Padula MP, et al. Methylation oftranslation-associated proteins in Saccharomyces cerevisiae: Identification ofmethylated lysines and their methyltransferases[J]. Proteomics, 2012,12(7):960-972.

[10] 胡瓊英,王開(kāi)正,譚小林,等. 原發(fā)性肝癌血清蛋白質(zhì)譜圖人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型研究[J]. 山東醫(yī)藥,2011,51(35):6-8.

[11] Taran K, Kobos J, Sporny S. Examination of expression of WT1 gene product and CD44adhesive molecule in nephroblastoma histologic types[J]. Pol J Pathol, 2008,59(3):177-182.

[12] Smerdel-Ramoya A, Zanotti S, Canalis E. Nephroblastoma overexpressed (Nov)induces gremlin in ST-2 stromal cell lines by post-transcriptional mechanisms[J]. J Cell Biochem, 2011,112(2):715-722.

Screening of proteins associated with pediatric bilateral wilms tumor

YANZe-chen1, DAI Xing, YANG Jin-jian, ZHANG Jun-jie, GUO Fei, YU Jie-kai,

ZHENGShu,WANGJia-xiang

(1TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Abstract:ObjectiveTo select the differentially expressed proteins of bilateral wilms tumor (BWT) by using SELDI-TOF-MS technology. MethodsA total of 10 serum samples of children with BWT(BWT group), 20 serum samples of children with Unilateral Wilms Tumor (UWT group) and 20 serum samples of healthy children(control group) were selected. SELDI-TOF-MS technology was used to detect the differentially expressed BWT proteins. ResultsTen difference BWT proteins peaks were found(P<0.01). The highest Youden′s index was obtained to select one differentially expressed protein with m/z of 5 648 Da. The selected expression BWT protein in BWT group, UWT group and control group was 3 889.36±1 796.83, 2 886.81±1 404.65 and 432.21±730.42, respectively(all P<0.01). ConclusionA differentially expressed protein of BWT group was successfully obtained by using SELDI-TOF-MS technology, which is expected to be a new marker for the early diagnosis and prognosis of BWT.

Key words:bological markers; nephroblastoma; proteomics

(收稿日期：2014-11-28)

通信作者簡(jiǎn)介：王家祥(1958-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)楦共繉?shí)體腫瘤的蛋白組學(xué)研究及小兒外科疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail:wjxzzu@126.com

作者簡(jiǎn)介：第一閆澤晨(1988-)，男，博士，研究方向?yàn)楦共繉?shí)體腫瘤的蛋白組學(xué)研究及泌尿外科疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：yanzechen@qq.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81172085/H1608)。

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ937；R737.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)02-0008-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.003