肝癌組織中HuR和HIF-1α的表達(dá)及其相關(guān)性

劉利平，江建新，鮑世韻，張育森，何婉(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院，廣東深圳5800;湖北省腫瘤醫(yī)院)

肝癌組織中HuR和HIF-1α的表達(dá)及其相關(guān)性

劉利平1，江建新2，鮑世韻1，張育森1，何婉1
(1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院，廣東深圳518020;2湖北省腫瘤醫(yī)院)

摘要:目的觀察人抗原R(HuR)和缺氧誘導(dǎo)因子(HIF) -1α在肝癌組織中的表達(dá)變化，并探討其相關(guān)性。方法取48例肝癌組織及癌旁組織標(biāo)本，采用免疫組化染色法檢測(cè)肝癌組織及癌旁組織中HuR和HIF-1α蛋白的表達(dá)，采用熒光定量PCR法檢測(cè)肝癌組織中HIF-1α mRNA的表達(dá)。結(jié)果肝癌組織中HuR和HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為67%和58%，顯著高于癌旁組織的19%和10% (P均＜0.01)。肝癌組織中HuR與HIF-1α蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.723，P＜0.01)。HuR蛋白高表達(dá)者中HIF-1α mRNA的表達(dá)較HuR蛋白低表達(dá)者顯著上調(diào)(P ＜0.05)。結(jié)論肝癌組織中HuR和HIF-1α蛋白表達(dá)上調(diào)且呈正相關(guān)關(guān)系，HuR可能增強(qiáng)HIF-1α mRNA的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)其表達(dá)。

關(guān)鍵詞:肝癌;人抗原R;缺氧誘導(dǎo)因子-1α; RNA結(jié)合蛋白

實(shí)體瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中，由于腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)快和新生血管功能缺陷，常常造成局部組織微環(huán)境缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF) -1α是介導(dǎo)腫瘤適應(yīng)缺氧狀態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄因子［1］，在缺氧狀態(tài)下可轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，與HIF-1β結(jié)合成為有活性的HIF-1復(fù)合物，再與下游靶基因的缺氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥［1，2］。然而缺氧狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄常常受到抑制，蛋白翻譯也通常受阻。人抗原R(HuR)為RNA結(jié)合蛋白，可通過(guò)與靶基因末端富含腺嘌呤和尿嘧啶的序列結(jié)合，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)蛋白翻譯［2，3］。因此，HIF-1α和HuR分別在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)性。本研究對(duì)肝癌組織中HIF-1α和HuR蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，分析二者的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇深圳市人民醫(yī)院2013～2014年行手術(shù)切除的肝癌患者48例，男46例、女2例，年齡31～65歲、平均49.5歲。其中乙肝表面抗原陽(yáng)性35例?；颊咝g(shù)前均未接受化療、放療及免疫治療。取手術(shù)切除的肝癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm以上)各48例份，液氮中保存?zhèn)溆?。?biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋。所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)。

1.2檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1HuR和HIF-1α蛋白檢測(cè)采用免疫組化法。將石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育15 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波抗原修復(fù)，滴加10%山羊血清37℃封閉1 h。棄封閉液，加入100 μL鼠抗人HuR單克隆抗體(1∶200稀釋)，4℃過(guò)夜。依次滴加生物素化二抗、親和素(試劑A)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的親和素(試劑B)，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察染色結(jié)果，以PBS代替一抗做為陰性對(duì)照。HuR陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核染棕黃色，HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)染棕色。結(jié)果判定采用半定量計(jì)分法，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率乘積來(lái)判定。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無(wú)特異染色為0分，輕度染色為1分，中度染色為2分，強(qiáng)染色為3分;陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無(wú)為0分，1%～25% 為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。兩項(xiàng)乘積等于0～4分為低表達(dá)，5～12分為高表達(dá)。

1.2.2HIF-1α mRNA檢測(cè)采用Real-time PCR法。取約2 mm3大小的腫瘤組織，加入TRIZol液提取細(xì)胞總RNA，取1 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Premier Primer 5軟件設(shè)計(jì)基因引物，HIF-1α引物上游5'-ACTTCTGGATGCTGGTGATTTG-3'，下游5'-GCTTCGCTGTGTGTTTTGTTCT-3';β-actin引物上游5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3'，下游5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。將cDNA稀釋10倍，向每個(gè)PCR反應(yīng)孔中加入1 μL，并加入10 nmol的上、下游引物各0.5 μL，無(wú)核酸酶的超凈水8 μL和SYBR Green Supermix 10 μL。PCR反應(yīng)在ABI 7900HT熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)上運(yùn)行，程序設(shè)置為: 95℃2 min; 95℃10 s，60℃60 s，循環(huán)40次; 72℃延伸10 min。擴(kuò)增完畢后進(jìn)行熔解曲線分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2－ΔΔCt計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用珋x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，非正態(tài)分布資料采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肝癌組織和癌旁組織中HuR和HIF-1α蛋白表達(dá)HuR蛋白在肝癌中的表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，為粗細(xì)不一的棕褐色顆粒，并有明顯的異質(zhì)性。肝癌組織和癌旁組織中的HuR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為67%(32/48)和19%(9/48)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。HIF-1α蛋白在肝癌中的表達(dá)主要定位于胞質(zhì)中，部分細(xì)胞核也有表達(dá)，呈棕黃色彌漫性分布。肝癌和癌旁組織中的HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為58% (28/48)和10% (5/48)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2肝癌組織中HuR蛋白與HIF-1α蛋白表達(dá)的相關(guān)性48例肝癌組織標(biāo)本中，HuR和HIF-1α均低表達(dá)14例，均高表達(dá)25例。同一標(biāo)本中以HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率乘積評(píng)分為橫坐標(biāo)，HuR表達(dá)評(píng)分為縱坐標(biāo)，制成散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，肝癌組織中的HuR與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.723，P＜0.01)。

2.3肝癌組織中HuR蛋白表達(dá)與HIF-1α mRNA的關(guān)系將肝癌組織根據(jù)HuR表達(dá)的高低分為兩組，HuR高表達(dá)組HIF-1α mRNA表達(dá)為7.96± 1.79，HuR低表達(dá)組為3.55±1.26，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3　討論

HuR蛋白是胚胎致死異常視覺(jué)基因家族中最重要的RNA結(jié)合蛋白，可通過(guò)與靶基因末端富含腺嘌呤和尿嘧啶的序列結(jié)合，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性并調(diào)控其蛋白翻譯。HuR在多種正常組織中都有表達(dá)，主要分布于細(xì)胞核，在炎性因子、缺氧等因素的刺激下表達(dá)增高［3，4］。HuR在膀胱癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌及結(jié)腸癌等惡性腫瘤中的表達(dá)較正常組織明顯升高，并與患者預(yù)后相關(guān)［5～7］。本研究發(fā)現(xiàn)，HuR蛋白在肝癌組織中的表達(dá)較癌旁組織中顯著增高，提示HuR可能與肝癌的發(fā)生關(guān)系密切。HuR通過(guò)與其靶基因(如c-myc、P53、Cyclin D1、Cyclin A、survivin、Bcl-2、COX-2、TNF-α、VEGF、MMP-9)結(jié)合，調(diào)控癌基因、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、炎癥因子、侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)分子，在腫瘤發(fā)生及惡性轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮重要作用［8，9］。

HuR蛋白的表達(dá)受多方面因素的調(diào)控。NF-κB、Smad轉(zhuǎn)錄因子可與HuR啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)HuR mRNA的表達(dá)。然而miR-9、miR-16、miR-34a、miR-125a和miR-519等微小RNA可與HuR的3'-末端翻譯區(qū)結(jié)合，下調(diào)HuR蛋白及mRNA的表達(dá)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，HuR與HIF-1α蛋白在肝癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，HIF-1α在腫瘤組織中的表達(dá)高低通常反映缺氧程度，提示缺氧可能是刺激HuR表達(dá)的重要因素。在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α與HIF-1β結(jié)合成為有活性的HIF-1復(fù)合物，與受其調(diào)節(jié)的下游靶基因HRE結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［1］。HIF-1α能否通過(guò)與HuR啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)其基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。

HIF-1α的表達(dá)與缺氧密切相關(guān)，在缺氧狀態(tài)下泛素化蛋白水解酶受抑制，HIF-1α蛋白降解減少，從而表達(dá)增加［1］。然而在缺氧狀態(tài)下細(xì)胞整體轉(zhuǎn)錄水平下降，因此HIF-1α mRNA的表達(dá)應(yīng)該受到抑制［3］。研究表明，HuR蛋白可以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性。為明確HIF-1α mRNA與HuR蛋白表達(dá)的關(guān)系，我們將肝癌組織根據(jù)HuR表達(dá)的高低分為兩組，結(jié)果顯示，HuR高表達(dá)組HIF-1α mRNA表達(dá)較低表達(dá)組明顯增高，提示HuR蛋白可能在mRNA水平調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)。研究證實(shí)，HIF-1α mRNA 的3'-和5'-末端翻譯區(qū)攜帶有多個(gè)ARE［8］。因此，雖然缺氧導(dǎo)致HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，但是HuR可能增加HIF-1α mRNA的穩(wěn)定性，從而上調(diào)HIF-1α蛋白的表達(dá)。同時(shí)，在CoCl2模擬缺氧條件下，HuR還可以促進(jìn)HIF-1α蛋白翻譯［8］。因此，HuR蛋白在肝癌組織中可以通過(guò)多種機(jī)制上調(diào)HIF-1α的表達(dá)。

綜上所述，HuR和HIF-1α蛋白在肝癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。HuR可能通過(guò)穩(wěn)定HIF-1α mRNA和促進(jìn)其翻譯，從而上調(diào)HIF-1α的表達(dá)。

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Expression and correlation of HuR and HIF-1α in hepatocellular carcinoma

LIU Li-ping1，JIANG Jian-xin，BAO Shi-yun，ZHANG Yu-sen，HE Wan
(1 The Second Clinical Medical College of Jinan University，Shenzhen People's Hospital，Shenzhen 518020，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and correlation of human antigen R (HuR) and hypoxia-inducible factor (HIF) -1α in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues.Methods Forty-eight cases of HCC tissue and adjacent tissue samples were collected from patients undergoing surgical resection.The expression of HuR and HIF-1α protein in the HCC and adjacent tissues was detected by immunohistochemical staining.The mRNA expression of HIF-1α in the HCC tissues was detected by fluorescent quantitative PCR.Results The positive expression rates of HuR and HIF-1α protein in the HCC tissues were 67% and 58%，respectively.These rates were significantly higher than the positive expression rates of HuR and HIF-1α protein (19% and 10 %) in the adjacent tissues (all P＜0.01).The expression of HuR protein was positively correlated with the expression of HIF-1α protein in the HCC tissues (r=0.723，P＜0.01).The mRNA expression of HIF-1α mRNA in the group with high expression of HuR protein was significantly up-regulated as compared with that of the group with low expression of HuR protein (P＜0.05).Conclusions The expression of HuR and HIF-1α protein was up-regulated and positively correlated with each other in the HCC tissues.HuR may enhance the stability of HIF-1α mRNA，and thus increase the expression of HIF-1α protein.

Key words:liver carcinoma; human antigen R; hypoxia-inducible factor-1α;RNA-binding protein

(收稿日期:2015-02-03)

通信作者簡(jiǎn)介:何婉(1978-)，女，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)槟[瘤基礎(chǔ)與臨床。E-mail: hewanshenzhen@ hotmail.com

作者簡(jiǎn)介:第一劉利平(1982-)，男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楦伟┗A(chǔ)與臨床。E-mail: leoliping@ aliyun.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81402041、81160311)。

文章編號(hào):1002-266X(2015) 18-0007-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R735.7

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.003