腫瘤患者自體外周血C I K/D C-C I K細胞培養(yǎng)制備技術(shù)及臨床應(yīng)用研究進展

祝仲珍 ，王占科 ，傅穎媛

(1、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江西 南昌330006；2、解放軍第九四醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330002)

生物治療是除化學(xué)治療、放射治療和手術(shù)治療以外的新型腫瘤內(nèi)科治療技術(shù)，自體免疫細胞治療技術(shù)作為腫瘤生物治療技術(shù)，被國家衛(wèi)生計生委列入允許臨床應(yīng)用的三類技術(shù)，其中腫瘤患者外周血細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞 (Cytokine-induced Killer/Dendritic Cells and Cytokine-induced Killer cells，CIK/DC-CIK細胞)治療技術(shù)是廣泛應(yīng)用于臨床的三類臨床醫(yī)療技術(shù)，其核心技術(shù)為腫瘤患者自體外周血CIK/DC-CIK細胞體外培養(yǎng)及其回輸技術(shù)?，F(xiàn)將國內(nèi)外腫瘤患者自體外周血CIK/DC-CIK細胞培養(yǎng)制備技術(shù)與生物治療研究進展，綜述如下。

1 自體外周血C I K/D C-C I K細胞

1.1 自體外周血CIK細胞概念 自體CIK細胞是指在體外由多種細胞因子誘導(dǎo)患者自體外周血單個核細胞 (peripheral blood mononuclearcell,PBMC)而生成的異質(zhì)細胞群。惡性腫瘤患者的免疫機能存在不同程度的受損害，CD3+、CD8+、CD56+細胞數(shù)量降低，增殖后的CIK細胞具有T細胞強大的抗腫瘤活性和NK細胞非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性殺瘤的特點。與PBMC相比，CIK細胞中 CD3+、CD8+、CD56+細胞比例明顯升高，CIK 細胞對腫瘤細胞有很強的殺傷力，而且，CIK細胞越多，殺瘤效果越好。CIK細胞己成為過繼細胞免疫治療主要方法[1]。2009年，自體免疫細胞(T細胞、NK細胞)治療技術(shù)已經(jīng)列入國家衛(wèi)生與計劃生育委員會首批允許臨床應(yīng)用的第三類醫(yī)療技術(shù)[2]，免疫細胞(T細胞、NK細胞)治療技術(shù)管理規(guī)范規(guī)定該技術(shù)適用于臨床上已完成安全性和有效性認證，并符合倫理要求，只涉及T細胞和NK細胞作為治療手段的醫(yī)療技術(shù)，這類技術(shù)包括自體CIK細胞、自體TIL細胞、自體DC/CIK細胞、自體CTL細胞、自體γδT細胞和自體NK細胞。這為腫瘤患者自體外周血CIK細胞培養(yǎng)技術(shù)與臨床治療研究成果轉(zhuǎn)化提供法律保證。

1.2 外周血DC-CIK細胞概念 自體外周血DCCIK細胞是自體DC細胞和CIK細胞共同培養(yǎng)后生成的異質(zhì)細胞群[3]。DC和CIK共培養(yǎng)24h后，IL12的分泌量是CIK細胞單獨培養(yǎng)的6.93倍;可以高表達 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+細胞， 低表達CD4+CD25+Treg細胞[4]，盡管DC細胞不具備直接殺傷腫瘤細胞作用，但DC細胞可刺激CIK細胞的增殖，分泌多種腫瘤殺傷細胞因子，比如TNFα和干擾素等[5]。自體外周血DC-CIK細胞抗腫瘤效果一般比CIK細胞好，但制備成本高。自身DC細胞與自身腫瘤抗原共刺激后，可增強抗腫瘤免疫應(yīng)答，目前常用于腫瘤細胞疫苗的臨床預(yù)防[6，7]。

2 自體外周血C I K/D C-C I K細胞培養(yǎng)與性能和安全指標檢測

2.1 CIK/DC-CIK細胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng) CIK/DCCIK細胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)流程主要包括外周血單個核細胞分離，添加細胞因子(干擾素和IL-2)和淋巴細胞刺激分子(CD3單克隆抗體)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)擴增等。CIK細胞培養(yǎng)技術(shù)是指通過貼壁等方法去除單核細胞(DC細胞)，只對淋巴細胞進行培養(yǎng)的技術(shù)；DC-CIK細胞培養(yǎng)技術(shù)是指外周血單核細胞(DC細胞)和CIK細胞分開培養(yǎng)，然后再共同培養(yǎng)的技術(shù)。DC-CIK細胞培養(yǎng)添加的細胞因子和CIK細胞培養(yǎng)添加的細胞因子有所不同，DC細胞的作用主要是腫瘤抗原提呈作用，為了增強DC-CIK細胞對不同腫瘤細胞殺傷的特異性，近年來，國內(nèi)外學(xué)者提出腫瘤細胞抗原負載DC細胞培養(yǎng)，可增強DC-CIK細胞對特異腫瘤細胞的殺傷作用[8]。腫瘤細胞抗原負載DC細胞培養(yǎng)技術(shù)是指將腫瘤細胞抗原和DC細胞共同培養(yǎng)，共同培養(yǎng)后的DC細胞對腫瘤細胞識別能力增強，在患者體內(nèi)對腫瘤抗原提呈給淋巴效應(yīng)細胞的能力也增強，有文獻報道，DC-CIK細胞在體外對腫瘤細胞具有更好的殺傷效果，而單純的腫瘤抗原負載DC細胞可作為預(yù)防腫瘤的免疫細胞疫苗，在體內(nèi)也可以發(fā)揮預(yù)防和抑制腫瘤細胞作用，DC-CIK細胞培養(yǎng)和制備，具有更好的臨床應(yīng)用前景[9]。

有關(guān)外周血DC細胞培養(yǎng)、CIK細胞培養(yǎng)以及DC-CIK細胞培養(yǎng)方法，文獻報道很多[10，11]。DC細胞培養(yǎng)主要根據(jù)DC細胞的貼壁功能移去懸浮細胞，在貼壁細胞中加入GM-CSF、IL4誘導(dǎo)DC細胞。抗原負載DC細胞培養(yǎng)在DC細胞培養(yǎng)過程中，根據(jù)患者腫瘤的類型添加自制或商品化的腫瘤細胞抗原，一般添加 IL-1β、IL6、TNF-α 后，培養(yǎng)一段時間收獲抗原負載的DC細胞。CIK細胞培養(yǎng)在去除 DC 細胞后，添加 IFN-γ、IL2、抗-CD3、IL1培養(yǎng)收獲CIK細胞。DC-CIK細胞培養(yǎng)先培養(yǎng)DC細胞和CIK細胞，然后再共同培養(yǎng)。

多種細胞因子可用于CIK/DC-CIK體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，在培養(yǎng)體系中添加的細胞因子種類對CIK/DC-CIK細胞培養(yǎng)效率和CIK細胞群種類具有重要影響，目前研究較多的細胞因子為IL12和IL15。IL12是一種免疫調(diào)節(jié)因子，可增強NK細胞和CD8+T細胞的細胞毒作用，誘導(dǎo)IFN-γ、TNF-α等分泌，也有文獻報道,IL12可和其它細胞因子如IL1β、IL2、IL4一起共同誘導(dǎo)CIK/DC-CIK細胞中的NK細胞活化和增殖，IL12能增強CIK/DC-CIK細胞毒活性，可能機制是降低Treg細胞的數(shù)量和抑制細胞凋亡，從而誘導(dǎo)CIK細胞的抗腫瘤活性增強[12-14]。雖然IL15單獨體外誘導(dǎo)不能顯著提高CIK細胞群中NK細胞的比例，但與DC細胞聯(lián)合培養(yǎng)，可大大提高DC-CIK細胞群中NK細胞比例，同時DC-CIK對靶細胞的殺傷作用也顯著增強[15]。

2.2 CIK/DC-CIK細胞CD分子檢測 CIK/DC-CIK細胞是以CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞為主的細胞群，隨著培養(yǎng)時間的延長，CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞的百分率均呈上升趨勢，而CD3+CD4+呈下降趨勢。臨床實驗室常見的檢測以CD3+CD8+和CD3+CD56+T細胞為主。

2.3 細胞毒活性測定 MTT法是常用方法。將培養(yǎng)后的DC-CIK細胞與腫瘤細胞株共培養(yǎng)，以DCCIK細胞為效應(yīng)細胞，腫瘤細胞做為靶細胞，效靶比為5:1,10:1,20:1不等,37℃ 5%CO2培養(yǎng)24h，加入MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490nm處測量各孔的吸光值。計算抑瘤率。由于MTT有致癌性，且要現(xiàn)配先用，現(xiàn)在已有CytoTox96非放射性細胞毒試劑盒可代替使用，操作簡便。

2.4 質(zhì)量與安全指標檢測 加強感染控制工作是自體CIK/DC-CIK細胞制備和治療安全有效的前提和保證。自體外周血CIK細胞培養(yǎng)制備需要在國家技術(shù)監(jiān)督部門批準并驗收的GMP(Good Manufacturing Practice)實驗室中完成。為保證治療質(zhì)量，每次收集的細胞數(shù)應(yīng)≥2×109個，活率應(yīng)≥95%，CD3+CD56+細胞應(yīng)占大多數(shù)，外源性因子(細菌、支原體、真菌、內(nèi)毒素、病毒)檢測合格。

3 自體外周血C I K細胞臨床免疫治療機理

自體外周血CIK、DC-CIK細胞至少包括細胞毒T淋巴細胞、輔助性T淋巴細胞、NK細胞和DC細胞以及一些尚未完全清楚的其它免疫細胞，這些CIK免疫細胞均有直接和間接殺傷或抑制腫瘤細胞的作用。自體CIK/DC-CIK殺傷腫瘤細胞的功能，已經(jīng)在體內(nèi)外實驗得到證實。其殺傷機理基本明確[16-18]。CIK/DC-CIK的生物學(xué)活性主要是：(1)增殖速度加快，CIK細胞的主要效應(yīng)細胞是CD3+CD56+細胞，在正常人外周血中只占1~5%，經(jīng)過10~14d的誘導(dǎo)，CD3+CD56+細胞迅速增多；(2)CIK細胞是以CD3+CD56+T細胞為主的異質(zhì)細胞群，較以NK細胞為主的LAK細胞具有更強大的殺瘤活性；(3)抵抗效應(yīng)細胞凋亡；有研究表明CIK細胞在培養(yǎng)中表達FasL，能抵抗FasL+腫瘤細胞引發(fā)的效應(yīng)細胞Fas-FasL凋亡，又可誘導(dǎo)Fas+腫瘤細胞凋亡[19]。

4 自體外周血C I K/D C-C I K細胞治療臨床應(yīng)用

目前臨床上多采用化療聯(lián)合CIK/DC-CIK細胞治療的方式對腫瘤患者進行抗瘤治療，每次輸入的CIK/DC-CIK細胞不低于1×109個，4周為 1個療程，CIK/DC-CIK細胞治療與化療不應(yīng)同時進行，一般間隔1~2周，為使治療安全有效，在使用CIK/DC-CIK細胞治療前應(yīng)掌握禁忌癥，在患者治療后1、3、6個月和一年進行治療效果評估。

4.1 胃癌 胃癌患者化療后造成食欲下降和睡眠質(zhì)量差，精神萎靡等癥狀。應(yīng)用自體外周血CIK/DCCIK免疫細胞回輸治療聯(lián)合化療對進展期胃癌術(shù)后患者進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整體治療效果明顯優(yōu)于單純化療組，其3年和5年生存率也明顯提高；胃癌相關(guān)腫瘤標記物CEA等含量明顯低于單純化療組。許多文獻報道，CIK治療胃癌患者治療效果還與CIK細胞的治療次數(shù)明顯正相關(guān)，提示外周血DC-CIK/CIK免疫細胞治療可作為胃癌治療的有效措施，聯(lián)合化療可明顯提高腫瘤患者的治療效果[20-22]。

4.2 肝癌 近年來許多學(xué)者研究觀察了患者自體外周血CIK/DC-CIK治療聯(lián)合肝動脈栓塞化療術(shù)(TACE)治療原發(fā)性肝癌患者(HCC)的效果并進行評價，在TACE間歇期間，用患者自體外周血CIK細胞進行回輸治療，發(fā)現(xiàn)觀察組生活質(zhì)量(QOL)明顯得到改善，1年生存率、3年生存率等指標均顯著高于對照組，提示患者自體外周血CIK細胞免疫治療可以提高HCC患者的生活質(zhì)量,延長生存期，可作為其它治療手段的有效輔助措施[23-25]。

4.3 乳腺癌 文獻報道患者自體CIK細胞免疫治療聯(lián)合化療治療晚期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，效果明顯優(yōu)于單純化療,可延長患者的生存時間，明顯降低患者厭食程度及疲倦乏力率,提高患者生活質(zhì)量,對體質(zhì)稍差的患者更加適合，可有效緩解化療的毒副作用[26-28]。

4.4 肺癌 肺癌患者手術(shù)比較困難，化療也容易出現(xiàn)耐藥問題，預(yù)后差。張菁超等研究了患者自體外周血CIK治療中晚期肺癌患者的效果，經(jīng)CIK細胞治療的患者血免疫球蛋白、T細胞亞群均得到明顯好轉(zhuǎn)，肺癌患者的CD3+CD4+T細胞和CD4+CD8+的比例明顯高于治療對照組。CIK免疫細胞治療效率為42.9%,疾病控制率為83.3%，提示CIK免疫細胞治療可通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng),提高治療有效率,提高患者生活質(zhì)量[29]。DC-CIK細胞聯(lián)合化療治療晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的臨床效果，DC-CIK聯(lián)合治療組患者的無進展生存期、總生存期及Karnofsky評分均高于單純化療組，提示DC-CIK細胞聯(lián)合化療可提高對非小細胞肺癌 (NSCLC)療效,改善NSCLC患者生存質(zhì)量,降低化療的毒副反應(yīng)[30-32]。

4.5 其它腫瘤 CIK或DC-CIK過繼免疫細胞可用于胰腺癌、腸癌、腎癌、白血病以及黑色素瘤等治療或聯(lián)合治療方面，安全性和有效性均有文獻報道[33，34]。CIK/DC-CIK細胞治療也存在嚴重的個體治療差異，治療有待進一步規(guī)范和管理，并進行多中心大樣本臨床療效研究，才可以得出明確的療效結(jié)論。

5 問題與展望

腫瘤免疫缺陷是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生與發(fā)展的主要原因，無論手術(shù)、還是放療和化療都不是從改善患者免疫系統(tǒng)進行腫瘤治療的，而且化療無法徹底殺死靜止期腫瘤細胞，容易造成腫瘤的復(fù)發(fā)[35]。自體外周血CIK細胞治療技術(shù)治療有一定的優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在：(1)細胞免疫治療不僅直接發(fā)生抗腫瘤作用，更重要的是糾正了患者細胞免疫功能低下的問題，促進患者抗腫瘤免疫功能[36]；(2)治療可用于產(chǎn)生耐藥性腫瘤患者的治療；(3)對于失去手術(shù)機會或已復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的晚期腫瘤患者，能迅速緩解其臨床癥狀，延長生存期[37]。自體外周血CIK細胞治療盡管具有安全有效等優(yōu)勢，但當(dāng)前仍存在一定的問題：一是回輸前質(zhì)量控制標準國內(nèi)外尚不統(tǒng)一，必須滿足一定的CIK細胞數(shù)和具有殺傷腫瘤細胞的免疫細胞百分比回輸?shù)襟w內(nèi)，才能達到一定的治療劑量；二是回輸次數(shù)尚沒有統(tǒng)一標準，而且受培養(yǎng)周期的約束；三是制備好的CIK細胞保存問題還存在困難，需要及時回輸；四是不同腫瘤患者、同一腫瘤患者不同階段的外周血CIK/DC-CIK在同樣的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)效果不同，這對標準化CIK/DC-CIK培養(yǎng)以及制定統(tǒng)一的標準操作程序(SOP)文件帶來困難；五是在管理上CIK細胞制備、檢測和應(yīng)用應(yīng)屬于不同組織管理，互不隸屬，互相監(jiān)督，保證自體CIK/DC-CIK細胞治療的安全性和可靠性。自體外周血CIK/DC-CIK細胞體外培養(yǎng)制備，回輸?shù)戎T多環(huán)節(jié)尚需要規(guī)范和管理，在自體CIK/DC-CIK細胞制備方面，細胞因子種類很多，需要添加多少種細胞因子以及多少劑量，研究不同患者外周血CIK最佳培養(yǎng)體系組成，都值得進一步研究和探討。

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