動物布魯氏菌病實驗室診斷與檢測技術(shù)進展

程建國張富榮李小東

(1.巴彥淖爾市動物疫病預防控制中心,內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000;

2.巴彥淖爾市職業(yè)技術(shù)學校,內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000;

3.巴彥淖爾市烏拉特后旗烏蓋蘇木獸醫(yī)工作站,內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000)

動物布魯氏菌病實驗室診斷與檢測技術(shù)進展

程建國1張富榮2李小東3

(1.巴彥淖爾市動物疫病預防控制中心,內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000;

2.巴彥淖爾市職業(yè)技術(shù)學校,內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000;

3.巴彥淖爾市烏拉特后旗烏蓋蘇木獸醫(yī)工作站,內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000)

實驗室診斷與檢測對防治動物布魯氏菌病(brucellosis)至關(guān)重要,其不僅可早期發(fā)現(xiàn)傳染源和隱性感染動物,而且可檢測動物通過疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體水平,為合理制定免疫程序提供科學依據(jù)。實驗室診斷與檢測動物布魯氏菌病常規(guī)方法包括:一般實驗室檢查、免疫血清學試驗和病原學檢查;高新生物技術(shù)包括:應用分子生物學技術(shù)檢測及熒光偏振試驗(FPA)。目前,我國對該病診斷的國家標準主要是依據(jù)細菌學和血清學檢測結(jié)果來確定。其中免疫血清學試驗是我國最常用的診斷與檢測方法,該方法不僅可用于動物布魯氏菌病的診斷與檢測,而且還用于人感染布魯氏菌病的診斷與檢測。但是,這種診斷與檢測方法在我國已經(jīng)使用半個多世紀,并且存在著許多弊端,諸如:非特異性反應、假陽性、前帶現(xiàn)象或動物自身免疫抑制等,因此還遠不能滿足對動物布魯氏菌病的防控需求。探索動物布魯氏菌病的實驗室診斷與檢測新技術(shù)以及高新分子生物學技術(shù)的研究進展,對于早期開展動物布魯氏菌病的分子流行病學調(diào)查、早期確診和防控均具有重要意義。

布魯氏菌病;實驗室;診斷;檢測

動物布魯氏菌?。╞rucellosis）簡稱布病，是由布魯氏菌引起的人、畜共患傳染病，其特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，臨床表現(xiàn)為低熱、關(guān)節(jié)腫脹、疼痛；可引起母畜流產(chǎn)、不孕；引起公畜睪丸腫脹、繁殖力下降；布魯氏菌還可駐留于其他組織器官，引起不同程度的局部病灶等損害。人感染布魯氏菌后，臨床表現(xiàn)多樣，有急性、亞急性和慢性之分。急性和亞急性可產(chǎn)生菌血癥，主要表現(xiàn)為體溫呈波型熱或長期低熱、寒戰(zhàn)、盜汗、全身不適、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)痛、肝脾腫大以及睪丸炎、附睪炎等，孕婦可能發(fā)生流產(chǎn)，有時可能累及多個器官，呈現(xiàn)不同程度臨床體征；慢性多侵犯脊柱和大關(guān)節(jié)，通常無菌血癥，但感染可持續(xù)多年。該病廣泛存在于世界各地。我國目前在人、動物間仍有發(fā)生；而在內(nèi)蒙古自治區(qū)，部分盟市的人間感染布魯氏菌病則呈現(xiàn)上升趨勢。按照《動物防疫法》，我國將該病列為二類傳染病，內(nèi)蒙古自治區(qū)已將該病列為重大動物疫病，加以防控。

1 一般實驗室檢查

白細胞正?；蚱?，淋巴細胞相對增多，有時可見異常淋巴細胞，少數(shù)病例血小板減少；細菌侵入機體后，可形成菌血癥。急性期可出現(xiàn)血沉加快。一般實驗室檢查僅用于人間感染布魯氏菌病的檢查。

2 免疫學檢測

目前，有諸多方法，歸納起來，不外乎血清中布魯氏菌抗體檢查和感染病料中是否存在布魯氏菌病原體的檢查兩大類。動物感染布魯氏菌一般于7～15d血清中可出現(xiàn)抗體（最早出現(xiàn)的抗體是IgM，然后是IgG和其他抗體）。檢測血清中的抗體是動物布魯氏菌病診斷和檢疫主要手段，其方法眾多，各有所長。因此，在實際工作中，最后選用一種以上的方法相互配合，以確保檢驗結(jié)果準確無誤。

2.1 凝集試驗

屬于傳統(tǒng)的試驗方法，包括玻板凝集試驗、虎紅平板凝集試驗（RBPT）、乳汁環(huán)狀試驗、緩沖平板凝集試驗（BPAT）、試管凝集試驗（SAT）。

SAT的優(yōu)點是操作簡便，判定容易，具有較高的診斷價值，一般不單獨使用，常常與其他測試方法組合使用。如凝集試驗檢出陽性后，再用補體結(jié)合試驗進行實驗室最后確診。RBPT或BPAT多用于現(xiàn)場和大群初篩。

2.1.1 試管凝集試驗與玻板凝集試驗 牛、馬、駱駝等大動物血清凝集價（或玻板凝集試驗中相當?shù)哪瘍r）達到1：100時，判定為陽性，1：50為可疑；羊豬、狗等血清凝集價：1：50為陽性，1：25為可疑。為了提高檢出率，對羊血清可用12%的高滲鹽水作為稀釋液?？梢刹⌒?～4周后應采血重檢，如仍為可疑，牛、羊可按陽性處理，豬、馬則須視具體情況而定，若畜群以往既無本病存在，目前又無臨床病例，且血檢無一例陽性出現(xiàn)，則可判定為陰性。人血清凝集價1：100為陽性。

2.1.2 虎紅平板凝集試驗 取受檢血清和虎紅平板抗原各0.03ml，滴加于玻片上，混勻，4～10min內(nèi)發(fā)生凝集者可判為陽性。虎紅平板抗原是用虎紅使抗原細菌染色成酸性（pH3.65左右）的緩沖平板抗原，可抑制引起非特異性反應的IgM和增強特異性抗體IgG的活性，其反應敏感、穩(wěn)定，特異性優(yōu)于試管凝集試驗，并且，特異性抗體IgG一旦消失，該試驗即變?yōu)殛幮?，因而，其試驗結(jié)果與布魯氏菌病轉(zhuǎn)歸有著明顯的一致性。

2.1.3 乳汁環(huán)狀試驗 該試驗常用于檢測動物新鮮乳汁，操作簡便，準確性較高，被廣泛用于牛、羊布魯氏菌病的診斷。

上述凝集反應，可出現(xiàn)由非特異性免疫球蛋白（例如因免疫接種而產(chǎn)生的IgM抗體）引起非特異性反應；另外，某些慢性病例產(chǎn)生不完全抗體，也不能呈現(xiàn)陽性反應，故應加以區(qū)別，以免誤判。對于疑難的病例，還可選擇抗免疫球蛋白試驗、巰基乙醇試驗、瓊脂擴散試驗或酶聯(lián)免疫吸附試驗等作為輔助診斷方法。在動物布魯氏菌病實驗室診斷方面，尤其在基層應用最廣泛的方法仍然是虎紅平板凝集試驗進行初篩，試管凝集試驗進行確診。

2.2 抗人免疫球蛋白試驗（Coomb’s）

機體受抗原刺激后可以產(chǎn)生“完全抗體”與“不完全抗體”。不完全抗體雖可與相應抗原結(jié)合，但不出現(xiàn)可見的凝集反應。若將含有不完全抗體的人或動物血清球蛋白作為抗原，注射于另一種動物（常用家兔）制成抗此球蛋白（抗IgG、IgA及IgM）的抗體。再將此抗球蛋白抗體加入抗原與不完全抗體復合物中，即可出現(xiàn)可見的凝集反應。Coomb’s滴度1：400++及以上為布病診斷標準。此方法多用于人間感染布魯氏菌病的診斷。

2.3 補體結(jié)合試驗（CFT）

CFT至今仍是布魯氏菌病的重要診斷方法，是國際貿(mào)易指定用于牛、羊布魯氏菌病實驗室確診的試驗方法。但KlausNielsen認為CFT需大量不同試劑以及各種對照組，試驗中需要大量的滴定法，結(jié)論也具有主觀性，而且不能鑒別人工免疫和自然感染，實驗條件復雜苛刻，鑒于這些缺點，CFT法不便向基層推廣，不宜在現(xiàn)場進行。此外，在CFT法基礎(chǔ)上，Plakett等提出了間接溶血試驗（IHAT），克服CFT中發(fā)生的前帶現(xiàn)象。Searson提出改良的微量CFT法，相比于CFT具有更高的敏感性和特異性，且價廉、快速，適于自動化及易于標準化。一般發(fā)病3周后出現(xiàn)IgG抗體，由于此抗體能維持較長時間，故診斷慢性布病意義較大。該試驗特異性高，滴度1：10++及以上可判為陽性。CFT多用于進出口檢疫和布魯氏菌病的確診。

2.4 變態(tài)反應檢查

布病為第IV型傳染性變態(tài)反應，一般在感染后的20～25d出現(xiàn)，故此法不易作早期診斷，主要用于綿羊、山羊、豬的慢性布病檢測。其方法是將布魯氏菌水解素0.2ml注射于羊尾根皺皺襞部或豬耳根部皮內(nèi)，24h及48d各判定一次，若注射部位發(fā)生紅腫，即可判為陽性。此法對慢性病例的檢出率較高，而且注射魯氏菌水解素后，無抗體產(chǎn)生，不妨礙以后的血清學檢查。該方法一般不常用。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

用ELISA檢測標本中的抗原或抗體是上世紀70年代初應用的一項技術(shù)。它較SAT和CAT敏感并且特異性高，操作方便，可用于確證和篩選試驗。目前牛種和豬種布魯氏菌的ELISA試驗是國際貿(mào)易中的指定試驗。豬布魯氏桿菌和綿羊布魯氏菌已有成熟的ELISA診斷技術(shù)ELISA分為間接ELISA 和競爭ELISA兩類。大部分間接ELISA使用純化的光滑型LPS作為診斷抗原，通常檢測的是IgG類免疫球蛋白，敏感性極高，但同時假陽性也較高。這類假陽性通常是由小腸結(jié)腸耶爾森菌09的類屬抗原成分所致，可由競爭ELISA所排除。ELISA是我國目前正在推廣和普及的免疫學診斷方法，截止目前，基層動物疫病防控部門尚未開始應用。

3 病原學檢查

從患畜血液、骨髓、關(guān)節(jié)液、腦脊液、尿液及淋巴等組織中可分離培養(yǎng)出布魯氏菌，該菌革蘭氏染色陰性，呈球形、球桿形或短桿形，新分離者趨向球形，多單在，很少成雙、短鏈或小堆狀排列。不形成芽孢和莢膜，偶爾有類似莢膜樣結(jié)構(gòu)，無鞭毛不運動。急性期患畜血液、骨髓陽性率可達80%，關(guān)節(jié)液可達50%，慢性患畜陽性率較低。布魯氏菌屬共有6個生物種、19個生物型。我國流行的主要是羊布魯氏菌病，其次為牛布魯菌病。布魯氏菌營養(yǎng)要求高，在專用培養(yǎng)基上4～7d或更長時間生長。菌落形態(tài)濕潤、圓形、表面光滑、無色透明；菌苔無色透明、濕潤，用布魯氏菌診斷血清與培養(yǎng)物做玻片和試管凝集試驗，呈陽性反應。

布魯氏菌病原分離，按照國家農(nóng)業(yè)部有關(guān)規(guī)定，為了確保生物安全，必須在國家指定的參考實驗室方可進行病原分離與鑒定，一般地市級及其以下基層動物疫病防控部門已不允許開展病原學檢查。

4 分子生物學技術(shù)的應用

PCR（聚合酶鏈反應）方法可在物種和生物型水平上進行布魯氏菌鑒定。這些技術(shù)要求最小的生物安全，并能在非常短的時間內(nèi)提供結(jié)果。分子生物學技術(shù)對診斷和防治布魯氏菌病開辟了廣闊的應用前景，但是，由于分子生物學技術(shù)屬于高新技術(shù)領(lǐng)域，所需的技術(shù)和設(shè)備要求較高，目前還不能在基層廣泛推廣應用，僅限于科研院所研究領(lǐng)域的應用。

4.1 多重聚合酶鏈反應（multiplex PCR）

Sreevatsan等運用多重PCR技術(shù)檢測牛布魯氏菌和牛分枝桿菌。該實驗采用兩個種特異性靶序列：①流產(chǎn)布魯氏菌的BCSP31K基因的一段序列；②牛分枝桿菌hsp65基因的一段重復序列，擴增后采用一種固相探測檢測擴增產(chǎn)物。杜昕穎等針對布魯氏菌外膜蛋白31kD、22kD和2a基因，設(shè)計引物進行多重PCR，經(jīng)過實驗優(yōu)化，確定了多重PCR中引物的最適濃度。多重PCR靈敏度高于普通PCR、特異性強，能在同一反應管中同時檢測多種病原體，準確性更高。

4.2 AMOS-PCR（abortus melitensis ovis suis-PCR）

AMOS-PCR是根據(jù)布魯氏菌不同種的IS711序列位置的不同設(shè)計引物，即一個引物瞄定在IS711上，其他不同的引物分別選在與IS711插入序列鄰近的單染色體DNA上，以代表種的特異性，通過擴增片段的大小來鑒別。Bricker等用AMOS-PCR方法對牛布魯氏菌、豬流產(chǎn)布魯氏菌及綿羊布魯氏菌的不同變種在24h內(nèi)即可進行分型，并能區(qū)分疫苗株和野毒株，從而為早期診斷和預防提供了科學依據(jù)。

4.3 巢式PCR

唐莉娟等根據(jù)GenBank中布魯氏菌的DNA序列，針對布魯氏菌膜蛋白Omp22基因設(shè)計引物進行巢式PCR，模板稀釋倍數(shù)為1010，可擴增到最終目的條帶，從而增加了檢測的靈敏性和可靠性。Kim等則將多重PCR和巢式PCR相結(jié)合，特異性更強，敏感度更高。

4.4 實時熒光定量PCR

Redkar等研究設(shè)計了實時熒光定量PCR方法，特異性檢測分析了流產(chǎn)布魯氏菌、羊型布魯氏菌和豬流產(chǎn)布魯氏菌。Bounaadja等也用該法鑒定布魯氏菌，同時與普通PCR進行比較，本法靈敏度高，可達到普通PCR的50～500倍，不與其他非布魯氏菌發(fā)生交叉反應，但可與普通PCR用相同的引物，操作簡單快速，易推廣，不易產(chǎn)生污染，是目前檢測動物布魯氏菌病效果較好并且可重復進行檢測的重要方法。

4.5 脈沖場凝膠電泳（PFGE）

PFGE是一種分離大分子DNA的方法，可以用來分離大小從25kb到10Mb的DNA分子。在普通的凝膠電泳中，大的DNA分子移動迅速接近，很難分離形成足以區(qū)分的條帶，在PFGE中，電場不斷的轉(zhuǎn)換方向，相對較小的分子在電場轉(zhuǎn)換后可以較快轉(zhuǎn)變移動方向，而較大的分子在凝膠中轉(zhuǎn)向較為困難，因此，小分子向前移動的速度比大分子快。

PFGE技術(shù)特點就是用來研究細菌的分子流行病學特點，能夠?qū)θ蚪M進行分析，最終分析的DNA超過90%，可以從整個基因組的角度考慮菌株間的關(guān)系。用稀有位點的限制性內(nèi)切酶進行酶切可以獲得菌種某亞種特有的電泳圖譜，是PFGE技術(shù)的顯著優(yōu)勢。PFGE技術(shù)分型能力強，重復性好、分辨率高、結(jié)果穩(wěn)定并易于標準化。

5 熒光偏振試驗（FPA）

FPA是一種利用物質(zhì)分子在溶液中旋轉(zhuǎn)速度與分子量大小成反比的特點，定量檢測抗原或抗體的一種分析方法。FPA是利用熒光素經(jīng)單一波長（藍光）的偏振光照射后，能吸收光能并發(fā)射出相應的偏振熒光，其強弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)。Gall D等用FPA檢測牛種布魯氏菌，并與其他血清學檢測方法進行比較，認為FPA是檢測牛布魯氏菌最穩(wěn)定的血清學方法。通過雙盲實驗證實FPA還可以區(qū)別牛種布魯氏菌感染和疫苗株S19免疫接種。FPA省去了洗滌步驟，減少了馥郁，大量節(jié)省了檢測時間，降低了檢驗費用，而且有較高的敏感度和特異性，是最有吸引力的牛種布魯氏菌血清抗體檢測方法。

6 綜述

雖然布魯氏菌檢測技術(shù)已有了很大的進展，但是還沒有一種單一的方法能適應任何情況下進行快速、準確診斷布魯氏菌病。各種診斷技術(shù)具有不同的適用范圍，而且各自都存在著一些缺點和局限性，因而不能相互取代。國家法定標準的檢測手段仍以細菌學和血清學診斷為主，血清學作為動物布魯氏菌病診斷的常規(guī)方法，但不足之處是檢測依賴于體內(nèi)的抗體水平，與其他抗體存在交叉反應而導致假陽性等；優(yōu)點是快速、簡便、費用低。以PCR為代表的分子生物技術(shù)不僅用于布魯氏菌菌種的鑒定，還能反映出布魯氏菌基因間存在的差異。實踐中通常需要根據(jù)檢測目的來擬定檢測方案，往往需要幾種方法相互配合，才能取得較為科學合理的檢測結(jié)果。選擇原則通常是以簡便、敏感性高的方法進行初篩，以防漏檢；以特異性高的方法進行確診，以剔除非特異性反應、前帶現(xiàn)象和假陽性。如首先以虎紅凝集試驗作為初篩，再以試管凝集試驗作為確診，是目前我國地市級及其以下基層動物疫病防控部門普及應用的方法；或以間接ELISA作為初篩，以競爭ELISA作為確診，是我國即將推廣的方法。未來隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，ELISA、PCR、PFGE、和FPA等高新技術(shù)方法，因其敏感性高、特異性強、檢測時間短，即將成為動物布魯氏菌病檢測的重要手段；未來還將會有更先進的檢測技術(shù)應用到動物布魯氏菌病的診斷和防治中，使診斷更加快速、簡便和準確，最終為徹底控制和消滅動物布魯氏菌病發(fā)揮更加積極的作用。

[1] 陸承平.獸醫(yī)微生物學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：97-102，265-270.

[2] 蔡寶祥，陳溥言，沈正達.家畜傳染病學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：76-81.

[3] 劉倩宏，吳清民，劉紅卿，等.布魯氏菌外膜蛋白OMP25的原核表達與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2008，44（8）：18-19.

[4] Matyas Z，F(xiàn)ujikura T. Brucellosis as a world problem[J].Dev Biol Stand，1984，56（7）：3-20.

[5] Nielsen K. Diagnosis of brucellosis by serology[J].Veterinary Microbiology，2002，90（1-4）：447-459.

[6] Plackett P，Cottew GS，Bess SJ. An indirect hemolisis test（IHLT）for bovine brucellosis[J].Aust Vet J，1976，（52）：136-140.

[7] Searson JE. Sensitivity and specificity of Brucella ovis infection in rams[J].Aust Vet J，1982，58（1）：5-7.

[8] Nielsen K. Diagnosis of brucellosis by serology[J]. Veterinary Microbiology，2002，90（1-4）：447-459.

[9] Sreevatsan S，Bookout JB，Ringpis F，et al. A muitiplex approach to moleculardetection of Brucella abortus and/or Mycobacterium bovis infection in cattle[J]. J Clin Microbiol，2000，38（7）：2602-2610.

[10] 杜昕穎，陳澤良，王玉飛，等.多重PCR特意檢測布魯氏菌方法的建立[J].解放軍預防醫(yī)學雜志，2008，26（5）：341-343.

[11] 楊海榮，關(guān)平原，范偉興.AMOS PCR 在布魯氏菌種型鑒定中應用的研究[J].中國動物檢疫，2007，24（10）：25-28.

[12] Bricker BJ，Hmling SM. Differentiation of Brucella abortus bv. 1，2 and Brucella melitensis，Brucella ovis，and Brucella suis bv. 1 by PCR[J]. J Clin Microbiol，1994，32（11）：2660-2666.

[13] 唐莉娟，陳創(chuàng)夫，王志遠，等.畜產(chǎn)品中布魯氏菌巢氏PCR快速診斷方法研究[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008，（4）：39-41.

[14] Kim S，Lee DS，Suzuli H，et al. Detection of brucella canis and Leptospira interrogans in canine semen by multiplex nested PCR[J]. J Vet Med Sci，2006，68（6）：615-618.

[15] Redkar R，rose S，Bricker B，et al. Real-time detection of Brucella abortus，Brucella melitensis and Brucella suis[J]. Mol Cell Probes，2001，15（1）：43-52.

[16] Bounaadja L，Albert D，Ch e nais B，et al. Real-time PCR for identification of Brucella spp.：A comparative study of IS711，bcsp31 and per target genes[J]. Vet Microbiol，2009，137（1-2）：156-164.

[17] Viqliocco AM，Silva Paulo PS，Mestre J，et al. Development and validation of an indirect enzyme immunoassay for detection of ovine antibody to Brucella ovis. Vet Microbiol，1997，54（3-4）：357-368.