稻瘟病誘導(dǎo)水稻幼苗葉片氧化還原系統(tǒng)的特征譜變化

唐成+陳露+安敏敏+馬愛(ài)梅+楊立明+羅玉明

摘要：為了探究水稻幼苗葉片受稻瘟病菌侵染后氧化還原狀態(tài)的影響，以水稻感病種質(zhì)日本晴、抗病種質(zhì)武運(yùn)粳7號(hào)為材料，接種本區(qū)域稻瘟病菌混合小種，測(cè)定水稻葉片內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（OD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等活性氧清除酶系的活性，以及丙二醛（MDA） 含量、可溶性蛋白含量。結(jié)果表明，稻瘟病菌侵染后水稻抗病材料、感病材料幼苗葉片內(nèi)SOD、OD、CAT等活性氧清除酶系活性均增強(qiáng)，且MDA含量、可溶性蛋白含量都呈增加趨勢(shì)。感病材料日本晴活性氧清除酶系活性的增加幅度明顯大于抗病材料。

關(guān)鍵詞：水稻；稻瘟??；活性氧清除酶系；氧化還原平衡

中圖分類號(hào)：S4354 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：002-302（204）2-04-03

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是全球約40%人口的主食。水稻產(chǎn)量直接影響我國(guó)的糧食安全及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。在影響水稻產(chǎn)量的生物脅迫因子中，稻瘟病是造成水稻減產(chǎn)的主要因素之一。稻瘟病在水稻生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段以及各個(gè)部位都有發(fā)生，主要有苗瘟、葉瘟、穗瘟、節(jié)瘟、谷粒瘟等類型，其中比較常見(jiàn)且對(duì)水稻危害最嚴(yán)重的是葉瘟、穗瘟[-2]。稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起的一種真菌性病害，主要特征是病斑具有明顯的褐色邊緣，中央灰白色，遇到潮濕環(huán)境時(shí)，病部呈灰色霉?fàn)钗颷3-4]。稻瘟病分布廣泛，在全球多個(gè)國(guó)家、地區(qū)都有流行。近幾年來(lái)，我國(guó)長(zhǎng)江中游、西南、東北等稻作區(qū)經(jīng)常發(fā)生大面積稻瘟病病害，水稻減產(chǎn)嚴(yán)重[5]。在病害流行的年份，一般減產(chǎn)0%～20%，較嚴(yán)重可達(dá)40%～50%，大發(fā)生時(shí)甚至顆粒無(wú)收[6-7]。稻瘟病因其分布范圍廣、造成危害大而受到廣泛重視[8]。植物抗病的生理生化反應(yīng)是通過(guò)酶催化活動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。正常情況下，植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧系統(tǒng)有利于保護(hù)植物體，同時(shí)也作為第二信使進(jìn)行信號(hào)傳遞，這時(shí)活性氧清除酶系、抗氧化系統(tǒng)處于較低水平的動(dòng)態(tài)平衡。一旦植物體受到病害脅迫，會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧積累，打破二者的平衡狀態(tài)，從而導(dǎo)致活性氧類物質(zhì)積累，打破植株體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的平衡，引發(fā)植物體的抗病反應(yīng)?；钚匝跚宄到y(tǒng)包括抗氧化酶類，如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（OD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（AX）等，抗氧化物質(zhì)有谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（ASA）、維生素E等[9]。 潘汝謙等研究表明，黃瓜感染霜霉病后體內(nèi)OD活性迅速升高，且SOD酶活性也明顯上升[0]。魏穎穎等研究表明，煙草與黃瓜花葉病毒互作中過(guò)氧化氫酶（CAT）活性顯著上升。本研究以水稻感病材料日本晴、抗病材料武運(yùn)粳7號(hào)為材料，接種江蘇省淮安市本地的稻瘟病菌混合生理小種后，測(cè)定水稻葉片內(nèi)SOD、OD、CAT等活性氧清除酶系的活性變化以及丙二醛（MDA ）含量、可溶性蛋白含量的變化，探討不同遺傳背景的水稻種質(zhì)資源與稻瘟病的抗性關(guān)系，旨在為防治稻瘟病提供依據(jù)。

材料與方法

材料

本試驗(yàn)選用的水稻品種為感病材料日本晴、抗病材料武運(yùn)粳7號(hào)，所接種的稻瘟病病菌菌株為淮安市本地的稻瘟病菌生理小種。挑選顆粒飽滿、大小一致的種子，洗凈后用水浸泡，在26～28 ℃保溫箱中保溫催芽，挑出露白一致的種子播于紗網(wǎng)上，將催芽4～6 d的幼苗（即當(dāng)苗長(zhǎng)至葉心期時(shí)）用海綿松松地包裹，嵌入打孔泡沫板（厚度5 cm）中，移至盛有2 L /2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液塑料箱，在H000GS型智能人工氣候箱中培養(yǎng)。晝夜溫度分別為28、26 ℃，空氣相對(duì)濕度為 70%～80%。幼苗適應(yīng)生長(zhǎng) d后進(jìn)行噴霧接種處理。

2噴霧接種處理

將上述稻種的水稻幼苗分為日本晴健康株對(duì)照、日本晴接菌處理株、武運(yùn)粳7號(hào)健康株對(duì)照以及武運(yùn)粳7號(hào)接菌處理株。健康株對(duì)照的處理方法是在水稻幼苗葉片上均勻噴霧接種緩沖液，接菌處理株則是在葉片上噴霧接種含淮安市本地稻瘟病菌混合小種的懸浮液，接種后0、、2、3、4、5、6 d天各取樣次，測(cè)定水稻幼苗葉片中OD、SOD、CAT等保護(hù)酶系活性的變化及MDA含量、可溶性蛋白含量變化，每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

3生理指標(biāo)的測(cè)定

3SOD活性測(cè)定稱取05 g水稻葉片放入研缽中，加5 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液研磨成勻漿，0 000 r/min離心 20 min，低溫保存上清液，其上清液即為酶的粗提取液，采用NBT還原法測(cè)定SOD活性[2-3]。

32OD活性測(cè)定取 mL上述酶的粗提取液，以愈創(chuàng)木酚為底物，測(cè)定470 nm處的吸光度，酶活性用每克蛋白每分鐘D470 nm增加值表示。

33CAT活性測(cè)定采用魏穎穎等的方法，將5 mL濃度為30%的H2O2用005 mol/L磷酸緩沖液（pH值為70）稀釋定容至25 mL，取反應(yīng)液28 mL，加入上述酶的粗提取液02 mL，以反應(yīng)液為對(duì)照，測(cè)定CAT活性[3]。

34MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[4]測(cè)定葉片的MDA含量。

35可溶性蛋白含量測(cè)定稱取05 g水稻葉片放入研缽中，加5 mL蒸餾水研磨成勻漿，0 000 r/min離心20 min，后取上清液 mL用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白含量，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。

4數(shù)據(jù)處理

用SSS 60 軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2接種稻瘟病菌對(duì)水稻幼苗形態(tài)的影響

從水稻葉片噴霧接種稻瘟病菌混合小種0 d后發(fā)病的表型來(lái)看，其稻瘟病發(fā)病表型已有明顯顯現(xiàn)。感病材料日本晴接菌處理株的幼苗葉片上邊緣及中央產(chǎn)生了橢圓形或梭形病斑，中間灰白色，外圍為褐色，最外層有黃色暈圈，呈現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)病表型。抗病材料武運(yùn)粳7號(hào)的幼苗葉片沒(méi)有明顯的病斑（圖）。由此可見(jiàn)，不同遺傳背景的水稻種質(zhì)受稻瘟病菌侵染后抗性表現(xiàn)不同。

22接種稻瘟病菌對(duì)水稻幼苗葉片活性氧清除酶系活性的影響

22接種稻瘟病菌的水稻幼苗葉片中SOD活性變化

SOD是植株體內(nèi)清除超氧陰離子的酶系，負(fù)責(zé)把過(guò)量的超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫。噴霧接種本地稻瘟病菌混合小種后，水稻幼苗葉片內(nèi)SOD的活性隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而提高（圖2）。日本晴幼苗葉片的SOD活性提高幅度較大，武運(yùn)粳7號(hào)葉片的SOD活性在接種后～5 d內(nèi)呈上升趨勢(shì)，接種后6 d稍有下降。稻瘟病菌侵染后可能引發(fā)了日本晴葉片內(nèi)超氧陰離子含量增加，植株需要增加SOD活性以快速清除過(guò)量的超氧陰離子。

222接種稻瘟病菌的水稻幼苗葉片中OD活性變化水

稻幼苗葉片接種稻瘟病菌之后，葉片內(nèi)OD的活性均顯著（圖3）。其中日本晴葉片接種后6 dOD活性比對(duì)照提高約6倍；武運(yùn)粳7號(hào)植株葉片內(nèi)OD活性變化相對(duì)平緩，提高幅度較小。OD是植物細(xì)胞用來(lái)清除過(guò)氧化氫、酚類、胺類等毒害物質(zhì)的抗氧化酶，該酶活性的提高暗示稻瘟病導(dǎo)致了葉片內(nèi)上述毒害物質(zhì)的積累，從而引發(fā)了OD活性的增強(qiáng)，以分解毒害物質(zhì)。

223接種稻瘟病菌的水稻幼苗葉片中CAT活性變化

接種稻瘟病菌混合小種后，日本晴葉片中CAT活性隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，抗病材料武運(yùn)粳7號(hào)葉片的CAT活性隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)（圖4）。CAT活性在稻瘟病病情較重的葉片內(nèi)活性較高，表明稻瘟病致使葉片的氧化還原平衡被打破，CAT活性增強(qiáng)以緩解植物受到的傷害。

224接種稻瘟病菌的水稻幼苗葉片中MDA含量變化

水稻幼苗葉片未受到稻瘟病菌侵染時(shí)，抗病材料與感病材料葉片中MDA含量差別較小，隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，抗病材料與感病材料葉片中MDA含量都呈上升趨勢(shì)，且武運(yùn)粳7號(hào)葉片內(nèi)MDA含量的增加幅度小于日本晴葉片（圖5）。MDA含量增加表明植株葉片在感染稻瘟病過(guò)程中發(fā)生了膜脂過(guò)氧化，日本晴葉片內(nèi)MDA含量增高表明其受稻瘟病傷害的程度重于武運(yùn)粳7號(hào)。

225接種稻瘟病菌的水稻幼苗葉片中的可溶性蛋白質(zhì)含量變化

稻瘟病菌侵染水稻后，水稻葉片細(xì)胞中的可溶性蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)了明顯變化。感病材料日本晴、抗病材料武運(yùn)粳7號(hào)葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量都呈上升趨勢(shì)，且感病材料葉片內(nèi)可溶性蛋白含量增長(zhǎng)幅度大于抗病材料（圖6）。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)中，稻瘟病菌侵染水稻抗病材料、感病材料幼苗葉片后，葉片內(nèi)SOD、OD、CAT等活性氧清除酶系活性均增強(qiáng)，且MDA含量、可溶性蛋白含量都呈增加趨勢(shì)。感病材料日本晴活性氧清除酶系活性的提高幅度明顯大于抗病材料，這可能是由于稻瘟病菌侵染的刺激，打破了植株體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的平衡，引起葉片內(nèi)活性氧含量增加，為了減緩活性氧對(duì)植物細(xì)胞的破壞，活性氧清除系統(tǒng)的酶類SOD、OD、CAT活性提高以清除活性氧，同時(shí)，由于活性氧的積累致使膜脂過(guò)氧化，故而膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物MDA含量增加。在病原物的刺激下，可能會(huì)抑制水稻體內(nèi)蛋白降解酶的活性或激活蛋白合成酶的活性，從而導(dǎo)致水稻葉片細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量增加?？共∧芰^強(qiáng)的水稻種質(zhì)因具有較強(qiáng)的免疫力，對(duì)病害抗性較強(qiáng)，受到稻瘟病菌侵染后，體內(nèi)活性氧的積累量較感病種質(zhì)相對(duì)較低，需要調(diào)動(dòng)的活性氧清除酶系統(tǒng)的增加幅度相對(duì)較小。本研究也表明氧化還原系統(tǒng)在水稻抗稻瘟病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在病害環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡體系的維持對(duì)植物的抗病性非常重要，SOD、OD、CAT等是植物體內(nèi)清除活性氧物質(zhì)的重要酶，它們的活性高低可作為植物抗逆性的指標(biāo)。SOD是植物體內(nèi)防御活性氧毒性的重要酶，它能清除超氧化物陰離子自由基，提高植物抗逆性。OD不僅能聚合成木質(zhì)素防御入侵病原菌，而且和CAT一樣屬于植物體內(nèi)重要的活性氧清除酶類，其作用是將H2O2降解成為無(wú)毒害的H2O、O2[5]。MDA是膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，它直接影響膜上結(jié)合酶的比例、活性，過(guò)量的MDA會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用?？扇苄缘鞍踪|(zhì)不僅是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物之一，同時(shí)也是植物性狀表現(xiàn)的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，甜瓜植株受蔓枯病菌侵染后，抗病材料的SOD、CAT 活性均高于感病材料，且抗病材料的OD活性提高幅度明顯小于感病材料[6]。陳罡等在研究稻瘟病菌粗毒素的致病力及其對(duì)水稻幼苗生理生化特性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，粗毒素處理后，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，OD活性提高，SOD活性表現(xiàn)為初期上升，一段時(shí)間后又有下降的趨勢(shì)[7]。郭連安等研究表明，不同稻瘟菌粗毒素濃度處理后，水稻幼苗的OD活性先升高后降低，可溶性蛋白含量顯著下降[8]。陳學(xué)平等研究表明，經(jīng)煙草普通花葉病毒處理后，抗病煙草品種CAT活性低于感病品種[9]。本研究表明，接種本地稻瘟病菌混合小種后，水稻抗病材料、感病材料葉片內(nèi)的活性氧清除酶系活性、可溶性蛋白質(zhì)含量基本都呈增加趨勢(shì)，并且感病品種的增加幅度明顯高于抗病品種，可能是日本晴作為稻瘟病病情較重的受體，其免疫能力較弱，受致病菌株侵染后，破壞了葉片內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的平衡，活性氧類物質(zhì)含量增加，對(duì)細(xì)胞造成了傷害，而其自身免疫系統(tǒng)保護(hù)機(jī)制的應(yīng)答調(diào)節(jié)了活性氧清除酶系，抗氧化物質(zhì)的活性增強(qiáng)，以減緩其受傷害程度。根據(jù)活性氧清除系統(tǒng)的酶系所催化的反應(yīng)過(guò)程，并結(jié)合植物體細(xì)胞內(nèi)活性氧的代謝過(guò)程，本研究提出了水稻受稻瘟病菌侵染后氧化還原系統(tǒng)狀態(tài)變化及活性氧代謝路徑圖，以期更好地理解水稻對(duì)稻瘟病的應(yīng)答機(jī)制（圖7）。

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