泰半夏小塊莖的誘導(dǎo)及工廠化育苗研究

孫燕　傅裘平　余樂　張成　李成忠　何正東

摘要：以泰半夏的無菌葉片、葉柄為材料，通過愈傷組織分化不定芽途徑，建立泰半夏工廠化育苗植株再生體系。結(jié)果表明，以葉片、葉柄為外植體，愈傷組織最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為：MS2，4-D 05 mg/L6-BA 30 mg/L、MS05 mg/L 2，4-D20 mg/L 6-BA ；愈傷組織在相同培養(yǎng)基中增殖后誘導(dǎo)小塊莖分化的最適培養(yǎng)基為：MS2 mg/L 6-BA。/2MS0%活性炭05 mg/L NAA培養(yǎng)基產(chǎn)生的根較粗壯、濃密。

關(guān)鍵詞：泰半夏；塊莖誘導(dǎo)；育苗

中圖分類號：S567239043文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：002-302（204）2-0067-03

半夏（inellia ternate）別稱野芋頭，為天南星科多年生草本植物，以其干燥塊莖入藥，性溫、味辛、有毒，具有降逆止嘔、消痞散結(jié)等功能，是我國傳統(tǒng)中藥材。生長于江蘇省泰州地區(qū)的半夏被稱為泰半夏，具有個(gè)大、質(zhì)堅(jiān)實(shí)、色白、粉性足等優(yōu)良性狀，是當(dāng)?shù)刂牡赖厮幉?。泰半夏多產(chǎn)于旱作的高沙土農(nóng)田中，以野生狀態(tài)生存。隨著種植制度的改革、旱改水面積的擴(kuò)大，以及化肥、農(nóng)藥、除草劑的廣泛使用，泰半夏野生資源已處于瀕危狀態(tài)，不能滿足用藥需求。人工栽培半夏用種量較大，加上生產(chǎn)退化等問題均導(dǎo)致半夏供應(yīng)長期處于緊缺狀態(tài)。因此，研究新的繁殖技術(shù)對于保護(hù)泰半夏道地藥材種質(zhì)資源有著積極意義。目前，泰州地區(qū)通常采用半夏塊莖或珠芽進(jìn)行繁殖，但因存在繁殖能力低及品種退化等問題而限制了泰半夏產(chǎn)量、質(zhì)量的提高。半夏分布范圍較廣，近年來湖北省荊門市、甘肅省西河縣、貴州省、云南省、湖南省、四川省、安徽省等地都陸續(xù)展開了保護(hù)當(dāng)?shù)氐赖匕胂乃幉馁Y源的組培研究，以塊莖、葉片、葉柄或珠芽等為外植體，得到半夏的再生植株[2-]。本試驗(yàn)以從塊莖為外植體獲得的泰半夏無菌苗為材料，建立適宜工廠化生產(chǎn)的再生體系，以期保護(hù)泰州半夏種質(zhì)資源，為泰半夏的工廠化育苗及規(guī)模種植奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

材料

試驗(yàn)材料為泰半夏組培苗，野生半夏塊莖外植體采自江蘇省泰興市。選擇生長旺盛、無病蟲害的健壯植株的塊莖，用自來水洗凈，流水沖洗30 min以上。用75%乙醇充分浸沒30 s，無菌水沖洗后再用0%HgCl2溶液充分浸泡0～6 min，無菌水反復(fù)漂洗6～8次。將塊莖切成05～08 cm的小塊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，形成無菌苗。

2方法

2外植體的處理

以半夏組培苗葉片及葉柄為外植體，無菌條件下，剪取生長一致的無菌苗頂部完全展開的幼嫩葉片，切成～2 cm的小塊，近軸面朝下接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；從生長良好的無菌苗上剪取葉柄接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

22基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽分化培養(yǎng)基以改良MS為基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖及 7 g/L 瓊脂，pH 值為58。塊莖啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS附加 02 mg/L NAA、2 mg/L 6-BA。生根培養(yǎng)以/2MS為基本培養(yǎng)基，附加5 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂、05 g/L活性炭，pH 值為58，2 ℃高壓滅菌5 min。愈傷組織誘導(dǎo)、分化及不定芽生根培養(yǎng)均在以下環(huán)境中進(jìn)行：培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，光照時(shí)間4 h/d，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx。

23激素處理

將無菌葉柄、葉片分別接種于不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合的培養(yǎng)基中，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。每處理6瓶，每瓶接種5個(gè)外植體，培養(yǎng)室培養(yǎng)。定期觀察小塊莖誘導(dǎo)及生長情況，2 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率計(jì)算公式如下：

誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×00%。

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織切成03～05 cm的小塊，接種至不定芽誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)小塊莖平均誘導(dǎo)數(shù)量。

24生根與壯苗

待叢生芽苗長至3～4 cm時(shí)，將其分株轉(zhuǎn)移到不同生根培養(yǎng)基中，接種2 d后觀察并記錄不同處理對植株生根的影響。每處理6瓶，每瓶5株試管苗。

25煉苗與移栽

待根長至～2 cm時(shí)煉苗移栽。移栽基質(zhì)設(shè)4種：A：園土；B：珍珠巖 ∶[KG-3]泥炭 ∶[KG-3]沙= ∶[KG-3]2 ∶[KG-3]2；C：育苗基質(zhì)；D：育苗基質(zhì) ∶[KG-3]園土= ∶[KG-3]。

2結(jié)果與分析

2不同激素對泰半夏愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將無菌葉片、葉柄接入不同激素配比的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)結(jié)果見表。在誘導(dǎo)愈傷過程中，誘導(dǎo)啟動(dòng)時(shí)間差距較小。葉片外植體接種5～7 d，葉片邊緣翹起，4 d時(shí)愈傷組織啟動(dòng)明顯，具葉脈的切口處是最易誘導(dǎo)的部位。葉片外植體誘導(dǎo)出淡黃色的愈傷組織，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)。誘導(dǎo)效果隨2，4-D濃度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)2，4-D濃度達(dá)0 mg/L時(shí)，葉片外植體誘導(dǎo)率較高。在一定范圍內(nèi)，葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率隨6-BA濃度增加而提高。當(dāng)2，4-D濃度達(dá)05 mg/L時(shí)，葉柄外植體誘導(dǎo)率較高，說明葉柄外植體對2，4-D的誘導(dǎo)較葉片敏感。當(dāng)6-BA濃度為2～3 mg/L時(shí)，葉柄外植體誘導(dǎo)率隨其添加濃度的升高而降低（除2，4-D濃度為0 mg/L處理）。啟動(dòng)葉片愈傷組織發(fā)生需要較高濃度的2，4-D、6-BA，激素濃度過高會對繼代培養(yǎng)產(chǎn)生激素積累，影響組培苗質(zhì)量，因此MS培養(yǎng)基添加2，4-D 05 mg/L6-BA 30 mg/L 為葉片愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基；葉柄最適誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加05 mg/L 2，4-D20 mg/L 6-BA。

2激素濃度對小塊莖誘導(dǎo)的影響

將愈傷組織再分化誘導(dǎo)產(chǎn)生小塊莖，接種后3～5 d即可觀察到愈傷組織有分化跡象，0 d左右即可分化出多個(gè)明顯的小塊莖，25 d左右小塊莖數(shù)量保持穩(wěn)定。誘導(dǎo)產(chǎn)生的小塊莖數(shù)量在一定范圍內(nèi)隨6-BA濃度的升高而增加。但當(dāng) 6-BA 濃度高于2 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)小塊莖數(shù)量有下降趨勢（除05 mg/L NAA處理）。因此最適激素比例為添加2 mg/L 6-BA（表2）。

23激素濃度對泰半夏叢生芽誘導(dǎo)生根的影響

分化產(chǎn)生的小塊莖在原培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，待叢生苗長至3～5 cm時(shí)，接入/2MS0%活性炭并添加不同濃度NAA的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。2 d后觀察結(jié)果，/2MS0%活性炭05 mg/L NAA培養(yǎng)基產(chǎn)生的根較粗壯、濃密。未添加任何生根劑的對照處理在接種7 d后塊莖邊緣同樣產(chǎn)生了較細(xì)弱的根系，但是啟動(dòng)時(shí)間晚，延長了培養(yǎng)周期，且根系細(xì)弱，不利于移栽（表3）。

24移栽基質(zhì)對泰半夏組培苗成活的影響

將完整的組培苗移至溫室大棚馴化3～5 d后，于岀瓶前 d開蓋煉苗。將根部培養(yǎng)基洗凈后，栽植于不同的移栽基質(zhì)中。直接移栽組培苗損失較大，成活率很低。因此，溫室煉苗可以極大地提高移栽成活率。由表4可見，D基質(zhì)處理下泰半夏試管苗移栽成活率最高，且組培苗生長健壯，溫室移栽成活30 d后即可移至室外進(jìn)行大田種植。

3結(jié)論與討論

本研究以葉片、葉柄為外植體，建立了泰半夏工廠化育苗

技術(shù)體系（圖）。以葉片、葉柄為外植體，愈傷組織最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為：MS05 mg/L 2，4-D30 mg/L 6-BA、MS05 mg/L 2，4-D20 mg/L 6-BA；愈傷組織在相同培養(yǎng)基中增殖后誘導(dǎo)小塊莖分化的最適培養(yǎng)基為：MS2 mg/L 6-BA。在最適培養(yǎng)基上葉柄形成明顯的愈傷組織時(shí)間要早于葉片，因此葉柄更適宜作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。生根苗經(jīng)溫室煉苗個(gè)月左右，展開卵圓形的幼葉。5月移栽至室外，緩苗0 d左右，陸續(xù)萌出新葉，迅速展開為三出復(fù)葉。7月移至大田后，大部分幼葉變黃枯萎，類似倒苗狀態(tài)。5～7 d卵圓形新葉重新萌出，并很快展開三出復(fù)葉。9月移栽至室外林下，原葉未變黃枯萎，7 d左右有新葉萌出，原葉葉色變深。張國泰等發(fā)現(xiàn)，在江蘇省南京市，半夏于7月中旬到8月中旬全部倒苗越夏，9月重新進(jìn)入秋季生長季，月上中旬倒苗越冬[2]。因此，泰半夏在冬季大倒苗之前，5—9月皆可以實(shí)現(xiàn)移栽入林下或于遮陰地帶種植。[FL）]

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