有限稀釋CR法篩選噬菌體cDNA文庫目標(biāo)克隆

周路+李建華+王丹+高劍峰

摘要：通過已知基因EST序列設(shè)計(jì)對(duì)特異性引物，經(jīng)過2輪有限稀釋法稀釋cDNA文庫；利用特異性引物作為探針，從cDNA文庫中篩選出目的克隆，最終獲得目的基因的全長(zhǎng)序列。在此基礎(chǔ)上，建立一種以CR為基礎(chǔ)，利用有限稀釋法快速、有效篩選噬菌體cDNA文庫、分離全長(zhǎng)目的基因的技術(shù)體系。

關(guān)鍵詞：有限稀釋法；噬菌體；cDNA文庫；CR

中圖分類號(hào)： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：002-302（204）2-0026-03

基因克隆是基因工程和分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，隨著2世紀(jì)生物技術(shù)的快速發(fā)展，基因克隆技術(shù)越來越多被廣泛應(yīng)用[-2]。976年，Hofstetter等通過雜交質(zhì)粒的方法第一個(gè)成功構(gòu)建cDNA文庫[3]以來，cDNA文庫構(gòu)建和篩選日益成熟并普及，并成為基因克隆及功能基因組研究的基本技術(shù)[4-5]，是最普遍、最經(jīng)典的克隆全長(zhǎng)基因序列的基本方法之一。傳統(tǒng)的篩庫方法以標(biāo)記核酸探針技術(shù)為基礎(chǔ)，其優(yōu)點(diǎn)在于準(zhǔn)確性和靈敏度高，缺點(diǎn)是放射性標(biāo)記探針容易造成污染且同位素半衰期短不穩(wěn)定，非放射性標(biāo)記探針以生物素和地高辛為基礎(chǔ)，成本高且所需工作量大。以CR為基礎(chǔ)篩選 cDNA 文庫的方法具有快捷、靈敏等特點(diǎn)，備受廣大科研工作者青睞，如楊曉明等以CR介導(dǎo)的cDNA文庫矩陣排列法進(jìn)行混合基因組文庫篩選、瞿文全等建立SSS（subsection screening）篩選cDNA文庫的方法、王志成等基于96孔板CR法篩選 cDNA 文庫[6-8]，等等。本研究嘗試構(gòu)建一種以CR為基礎(chǔ)，結(jié)合有限稀釋法篩選cDNA文庫的方法，在能夠快速有效分離出目的基因的基礎(chǔ)上，減少篩選cDNA文庫的工作量。

材料與方法

材料

λ噬菌體cDNA文庫篩選使用由新疆石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院構(gòu)建并保存的中國美利奴羊混合組織cDNA文庫，宿主菌株為XL-Blue MRF，hagemid Excision所用菌株為XLOLR，均含四環(huán)素抗性。cDNA 文庫構(gòu)建及宿主菌株來自ZA Express cDNA Synthesis Kit試劑盒，購自Stratagene公司。

2試劑

LB液體和固體培養(yǎng)基、LB broth with supplement、NZY Agar，NZY Top Agar、5×NZY Broth、SM溶液、卡那霉素、四環(huán)素，均購自索萊寶公司；ITG和X-Gal，購自科百奧公司；瓊脂粉、瓊脂糖、低熔點(diǎn)瓊脂糖、MgSO4，均購自Amresco公司；其余分子生物學(xué)試劑均為國產(chǎn)。

3引物

利用GenBank中公布的綿羊[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]預(yù)測(cè)基因EST序列，用SeqMan軟件對(duì)EST序列拼接去載體，獲得目的序列。將確定好的[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]基因序列，利用比較基因組學(xué)方法，比對(duì)尋找3′和 5′-UTR區(qū)域內(nèi)的高度保守序列，使用remier rimer 50軟件和NCBI上rimer-Blast工具設(shè)計(jì)特異性引物，并提交北京華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

4CR反應(yīng)條件

采用天根2×Taq CR Master Mix試劑盒，CR反應(yīng)體系為：0×CR buffer，25 μL；25 mmol/L MgCl2，20 μL；0 mmol/L dNTMix，05 μL；0 μmol/L 正、反向引物，各 μL；模板，2 μL；Taq酶， U；ddH2O，補(bǔ)至 25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸8 min。CR反應(yīng)結(jié)束，用%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外凝膠成像儀觀察并照相保存。

5λ噬菌體cDNA文庫篩選

λ噬菌體cDNA文庫篩選流程見圖。

5宿主菌的制備用接種環(huán)蘸取XL-Blue MRF′菌液在含有四環(huán)素終濃度為2 μg/mL的LB平板上劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)；用接種針在平板上挑取個(gè)單菌落，于20 mL LB broth with supplement中30 ℃、220 r/min振蕩過夜培養(yǎng)；培養(yǎng)菌液 000 g離心5 min，棄上清，加入0 mmol/L MgSO4溶液將菌株細(xì)胞重懸稀釋調(diào)至D600 nm值為06～0，4 ℃保存?zhèn)溆谩LOLR菌制備過程與XL-Blue MRF′相同。

52λ噬菌體cDNA目的基因確定取λ噬菌體cDNA擴(kuò)增文庫菌液2 μL進(jìn)行CR檢測(cè)。

53λ噬菌體cDNA擴(kuò)增文庫的第輪有限稀釋篩選根據(jù)CR檢測(cè)結(jié)果能夠獲得特異性條帶，將此擴(kuò)增文庫菌液E管編號(hào)0；另取0只5 mL E管并編號(hào)～0號(hào)管，加入00 μL LB broth with supplement培養(yǎng)基，依次從各管中取00 μL培養(yǎng)菌液，反復(fù)吸打充分混勻，進(jìn)行有限稀釋；取有限稀釋的各管菌液4 μL進(jìn)行CR檢測(cè)，如～0號(hào)管CR檢測(cè)中～9號(hào)管有特異性條帶，而0號(hào)管無，則選取9號(hào)管為最大稀釋倍數(shù)的陽性管。[FL）]

[FK（W7][TZLtif][FK）]

[FL（2K2]

54最大稀釋倍數(shù)陽性管的培養(yǎng)吸取最大稀釋倍數(shù)的陽性管噬菌體cDNA擴(kuò)增文庫溶液4 μL與400 μL XL-Blue MRF′宿主菌混合均勻，37 ℃溫育20 min；加入600 μL LB broth with supplement培養(yǎng)基混勻，37 ℃振蕩培養(yǎng)0 h；取培養(yǎng)菌液2 μL進(jìn)行CR檢測(cè)。

55文庫第2輪有限稀釋篩選經(jīng)CR檢測(cè)有特異性條帶，則將對(duì)應(yīng)E管編號(hào)為a；另取0支5 mL E管各加入00 μL LB broth with supplement培養(yǎng)基，依次標(biāo)號(hào)a～j，從培養(yǎng)過的最大稀釋倍數(shù)陽性管取00 μL菌液加入到a號(hào)管，反復(fù)吸打充分混勻，進(jìn)行有限稀釋；將a～j稀釋完成的菌液 37 ℃ 振蕩培養(yǎng)0 h，取各管培養(yǎng)液2 μL進(jìn)行CR檢測(cè)，確定最大稀釋倍數(shù)的陽性管；將最大稀釋倍數(shù)的陽性管37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2 h，平均分裝成2管，第管進(jìn)一步進(jìn)行有限稀釋，驗(yàn)證陽性克隆的穩(wěn)定性，驗(yàn)證完成，第2管用于噬菌體單板的挑取。

6陽性噬菌體斑的挑取

經(jīng)過2輪有限稀釋篩選，取最大稀釋倍數(shù)的陽性管菌液2 μL與200 μL振蕩過夜培養(yǎng)的XL-Blue MRF′菌液（D600 nm≈6）混合，并吸打均勻，于37 ℃溫育20 min；將混合菌液加入到8 mL，溫育在48 ℃的NZY Top Agar中，混合混勻后將NZY Top Agar混合液均勻地倒入預(yù)熱的NZY Agar平板上超過20 min，至平板凝固；將凝固后的平板倒置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)7～8 h，直至長(zhǎng)出清晰的噬菌斑；逐個(gè)從平板上挑取噬菌體單斑于500 μL LB broth with supplement培養(yǎng)基，室溫條件下溫育～2 h，噬菌體溶液進(jìn)行CR檢測(cè)，鑒定為陽性后進(jìn)行hagemid Excision。

7hagemid Excision

在0 mL離心管中，加入50 μL混勻的噬菌體溶液，37 ℃ 溫育5 min；在離心管中加入2 mL LB broth with supplement培養(yǎng)基，37 ℃、260 r/min振蕩培養(yǎng)25～3 h；菌液 65～70 ℃ 熱激20 min，以 000 g離心5 min，收集上清于無菌離心管中；取00 μL上清與200 μL XLOLR細(xì)胞吸打混勻，37 ℃ 溫育5 min；加入40 μL 5×NZY Broth，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)45 min；加入5 μL 20% ITG和40 μL 25 mg/mL X-Gal充分混勻，取00 μL涂板在含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，倒置37 ℃培養(yǎng)過夜；用滅菌牙簽挑取平板上白色單菌落進(jìn)行CR鑒定，陽性單克隆經(jīng)液體培養(yǎng)，送交北京華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

2結(jié)果與分析

2引物的設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)引物為[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]-F：5′-AACCAAAGCTGTTGACAGATGAGAAC-3′；R：5′-GCGCTGCAGTCGACACTAGTGGATC-3′。

22λ噬菌體cDNA擴(kuò)增文庫目的基因的確定

取2 μL綿羊cDNA擴(kuò)增文庫38×08 FU/mL，利用[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]引物進(jìn)行CR檢測(cè)，經(jīng)%瓊脂糖凝膠電泳與CR marker對(duì)比，綿羊cDNA擴(kuò)增文庫在 800 bp 具有特異性條帶（圖2），表明文庫中含有目的基因。

[FK（W][TZL22tif][FK）]

23有限稀釋CR法目的基因篩選

由圖3可見，在第輪有限稀釋篩選中，～0號(hào)管均有特異性條帶，且條帶亮度逐漸降低，說明～0號(hào)管中總的克隆種類呈指數(shù)降低，目的基因克隆數(shù)在減少；9～0號(hào)管特異性條帶微弱，說明9～0管中含有目的基因克隆且克隆數(shù)很少，9～0號(hào)管為最大稀釋倍數(shù)陽性克隆管。

對(duì)9～0號(hào)管進(jìn)行富集培養(yǎng)，取培養(yǎng)菌液2 μL進(jìn)行CR驗(yàn)[CM（25]證，結(jié)果由圖4可見，9～0號(hào)均有明顯的特異性條帶，能[CM）]

[FK（W8][TZL33tif][FK）]

[FK（W0][TZL44tif][FK）]

夠進(jìn)行第2輪篩選。

取0號(hào)培養(yǎng)管菌液00 μL進(jìn)行第2輪有限稀釋，取菌液經(jīng)CR檢測(cè)，結(jié)果由圖5可見，a～j均出現(xiàn)特異性條帶，各稀釋管中均包含目的基因克隆；a～f條帶亮度均一，g～j條帶亮度逐漸增加，表明陽性克隆數(shù)在增加。這是有限稀釋法的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過第輪和第2輪篩選，非陽性克隆在減少，陽性克隆數(shù)經(jīng)過富集擴(kuò)大培養(yǎng)后大量增加，能夠有效地篩選含目的基因的陽性克隆。

[FK（W9][TZL55tif][FK）]

為進(jìn)一步確定j號(hào)管能夠進(jìn)行hagemid Excision，對(duì)j號(hào)管進(jìn)行有限稀釋驗(yàn)證。由圖6可見，在有限稀釋的j號(hào)管 ～6 份檢測(cè)樣本中均有特異性條帶，表明第2輪有限稀釋能夠進(jìn)行hagemid Excision。

[FK（W9][TZL66tif][FK）]

24hagemid Excision

經(jīng)過2輪有限稀釋篩選，經(jīng)hagemid Excision，隨機(jī)挑取6個(gè)單克隆進(jìn)行CR鑒定，結(jié)果由圖7可見，4個(gè)單克隆有明顯的特異性條帶，鑒定為含有目的基因的單克隆，將單克隆菌液送交測(cè)序。

[FK（W0][TZL77tif][FK）]

25測(cè)序結(jié)果

將測(cè)序得到的TORAI基因序列，運(yùn)用DNAstar中Seqman進(jìn)行拼接，在NCBI上載體搜索工具VecScreen去載體，對(duì)序列進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，并將序列提交GenBank，GenBank登錄號(hào)為KF779494。

3結(jié)論與討論

篩選cDNA文庫是獲取全長(zhǎng)目的基因的基本方法之一。從cDNA文庫中獲得目的全長(zhǎng)基因，建立該基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)調(diào)控等研究體系，是在基因組水平上研究特定生物器官、組織、發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)的前提和基礎(chǔ)。目前，基于CR法從混合文庫中篩選陽性單克隆的方法[9，]越來越受到關(guān)注。本試驗(yàn)構(gòu)建了一種快速篩選噬菌體cDNA文庫的方法——有限稀釋CR法，與常規(guī)CR篩選cDNA文庫方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏、篩選快速、經(jīng)濟(jì)有效等優(yōu)點(diǎn)。該方法以特定基因組DNA為探針篩選噬菌體cDNA文庫中該基因的全長(zhǎng)序列，擺脫了傳統(tǒng)噬菌體文庫鋪板培養(yǎng)、分板洗脫等較為繁瑣的操作步驟，只經(jīng)過2輪CR就可篩選到目的基因，并將目的基因富集到較高水平，整個(gè)過程只需4 d時(shí)間。利用此項(xiàng)技術(shù)，能夠快速有效地篩選噬菌體cDNA文庫中全長(zhǎng)序列基因，在篩選過程中不需要探針標(biāo)記，降低了成本，提高了安全性，同時(shí)也降低了假陽性對(duì)試驗(yàn)的干擾。

有限稀釋CR法快速篩選噬菌體cDNA文庫技術(shù)不僅原理簡(jiǎn)單，具有普遍適用性，而且具有一定的可行性和科學(xué)性，可以根據(jù)研究需要進(jìn)行改進(jìn)。如需要篩選大量已知基因，可在對(duì)庫液的有限稀釋時(shí)進(jìn)行多對(duì)引物不同基因的統(tǒng)一篩選，這樣使得篩選cDNA文庫更加高效；如對(duì)于某些在文庫中豐度比較低的基因，可以先有限稀釋cDNA文庫，找到最高的有限稀釋倍數(shù)再進(jìn)行培養(yǎng)，提高陽性克隆在稀釋菌液中的分布，再按本試驗(yàn)步驟進(jìn)行2輪有限稀釋，可得到目的基因的單克隆。因此，在篩選文庫之前，應(yīng)確定文庫中是否含有所要的陽性克隆，對(duì)文庫進(jìn)行滴定，再進(jìn)行有限稀釋確定基因的豐度；還可對(duì)λ噬菌體cDNA擴(kuò)增文庫進(jìn)行MASS Excision protocol，將hagemid Excision菌液保存，并利用有限稀釋CR法對(duì)大量基因進(jìn)行篩選，達(dá)到高效篩選cDNA文庫的目的。