iPSC-MSCs對CoCl2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷時(shí)線粒體功能的影響*

楊　焰，李　慧，孫占朋，胡春林，荊小莉，魏紅艷，廖曉星，李　欣(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，廣東廣州510080)

?

iPSC-MSCs對CoCl2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷時(shí)線粒體功能的影響*

楊焰，李慧，孫占朋，胡春林，荊小莉，魏紅艷，廖曉星，李欣△
(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，廣東廣州510080)

［摘要］目的:觀察誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(iPSC-MSCs)對氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響，并探討其可能機(jī)制。方法:用CoCl2處理PC12細(xì)胞建立化學(xué)損傷模型，加入iPSC-MSCs共培養(yǎng)。用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)比色法檢測細(xì)胞存活率，Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡比率，JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞線粒體膜電位，免疫熒光觀察iPSC-MSCs向PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體的情況。結(jié)果:用CoCl2(400 μmol/L)處理PC12細(xì)胞24 h可使其凋亡明顯增多，線粒體膜電位明顯下降。與iPSC-MSCs共培養(yǎng)能減輕PC12細(xì)胞的凋亡，使其膜電位恢復(fù)。iPSC-MSCs可以與PC12細(xì)胞間形成隧道納米管并向PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體。結(jié)論: iPSC-MSCs可以減輕CoCl2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，機(jī)制可能與其向PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］氯化鈷; PC12細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞;線粒體

［修回日期］2015-03-30

Effects of iPSC-MSCs on mitochondria of PC12 cells injured by CoCl2

YANG Yan，LI Hui，SUN Zhan-peng，HU Chun-lin，JING Xiao-li，WEI Hong-yan，LIAO Xiao-xing，LI Xin
(Department of Emergency，The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail: xlidoct@ qq.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of induced pluripotent stem cells-derived mesenchymal stem cells (iPSC-MSCs) on cobalt chloride (CoCl2) -induced injuries of PC12 cells and its possible mechanism.METHODS: PC12 cells were exposed to CoCl2to set up a chemical-induced cellular injury model and were cocultured with iPSC-MSCs.The cell viability was tested by CCK-8 assay.The apoptosis was measured by flow cytometry using Annexin V/PI staining.The mitochondrial membrane potential (MMP) was analyzed by flow cytometry using JC-1 staining.Immunofluorescence was employed to observe mitochondrial transfer from iPSC-MSCs to PC12 cells.RESULTS: Apoptosis of PC12 cells was increased and MMP of PC12 cells was decreased after exposed to CoCl2at concentration of 400 μmol/L for 24 h.Coculture of PC12 cells with iPSC-MSCs reduced the apoptosis and recovered the MMP of the PC12 cells.Tunneling nanotubes were formed between iPSC-MSCs and PC12 cells，through which the iPSC-MSCs transferred the mitochondria to the PC12 cells.CONCLUSION: iPSC-MSCs protect PC12 cells from CoCl2-induced injuries，which may be associated with the mitochondrial transfer from iPSC-MSCs to PC12 cells.

［KEY WORDS］Cobalt chloride; PC12 cells; Apoptosis; Induced pluripotent stem cells; Mitochondria

缺血缺氧性腦損傷患者遠(yuǎn)期神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致患者死亡［1］。目前已有應(yīng)用干細(xì)胞治療缺血缺氧性腦損傷的報(bào)道。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其治療作用機(jī)制可能涉及干細(xì)胞的旁分泌、轉(zhuǎn)分化、減輕局部組織炎癥反應(yīng)以及促進(jìn)血管生成等方面［2-3］。2012年Islam等［4］在Nature Medicine上首次報(bào)道，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞間形成隧道納米管(tunneling nanotubes，TNTs)，并通過這些納米管轉(zhuǎn)移線粒體到Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，使受損肺泡恢復(fù)生物學(xué)活性，減輕膿毒癥所致的小鼠急性肺損傷。早前報(bào)道骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體［5］，而關(guān)于干細(xì)胞能否轉(zhuǎn)移線粒體到神經(jīng)元進(jìn)而治療缺血缺氧性腦損傷未見相關(guān)報(bào)道。為此，我們在體外建立CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞化學(xué)缺氧損傷模型，加入誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells-derived mesenchymal stem cells，iPSC-MSCs)與之共培養(yǎng)，觀察iPSC-MSCs是否可向PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體，探討iPSC-MSCs保護(hù)PC12細(xì)胞減輕損傷的作用及其可能機(jī)制。

材料和方法

1細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的iPSCMSCs(GFP-iPSC-MSCs)及N1-iPSC-MSCs由香港大學(xué)連其周教授提供。PC12細(xì)胞及GFP-iPSC-MSCs置于含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone)中培養(yǎng)，N1-iPSC-MSCs置于含10%胎牛血清、1% MEM非必需氨基酸(Gibco)和1% GlutaMAX Supplement(Gibco)的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)是否使用CoCl2誘導(dǎo)損傷及iPSC-MSCs干預(yù)處理將PC12細(xì)胞分為3組: (1)正常對照(control)組; (2) CoCl2組:根據(jù)CoCl2(Sigma)處理濃度將PC12細(xì)胞分為0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L 和600 μmol/L CoCl2共4組，每組5例; (3) CoCl2+ GFP-iPSC-MSCs組。各組PC12細(xì)胞均以每孔1.5× 105接種于6孔板，接種24 h后正常對照組繼續(xù)以普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，CoCl2組及CoCl2+ GFP-iPSC-MSCs組以含400 μmol/L CoCl2的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，繼之CoCl2組更換為不含CoCl2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，CoCl2+ GFP-iPSC-MSCs組每孔加入1.5×105GFP-iPSC-MSCs細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1細(xì)胞存活率測定使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8 (Cell Counting Kit-8，CCK-8; Dojindo)檢測細(xì)胞存活率。PC12細(xì)胞以每孔1×104接種于96孔板，各組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要各組分別加入含不同濃度CoCl2的培養(yǎng)基處理24 h。終止培養(yǎng)后向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37℃孵育1.5 h，用酶標(biāo)儀測定每孔在450 nm波長處的吸光度A值。取各組5個(gè)復(fù)孔的平均值，按下列公式計(jì)算存活率:存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值－空白組A值)/(正常對照組A值－空白組A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

3.2流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinV-APC/PI雙染)檢測細(xì)胞凋亡PC12細(xì)胞以每孔1.5×105接種于6孔板，按不同實(shí)驗(yàn)分組對各組細(xì)胞進(jìn)行處理。消化收集各組細(xì)胞，洗滌2遍。加入500 μL的binding buffer重懸后加入5 μL Annexin V-APC染液(凱基生物)，混勻后再加入5 μL PI染液(凱基生物)。室溫下避光反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀(Beckman-Gallios)進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.3流式細(xì)胞術(shù)(JC-1染色)檢測線粒體膜電位用終濃度2 μmol/L的分子探針Cell Trace Violet對PC12進(jìn)行染色標(biāo)記。將標(biāo)記后的PC12細(xì)胞以每孔1.5×105接種于6孔板，按不同實(shí)驗(yàn)分組對各組細(xì)胞進(jìn)行處理。消化收集各組細(xì)胞，用1 mL PBS重懸，每管加入濃度為1 μmol/L的JC-1(Abcam)染料2 μL，37℃孵育30 min。洗滌1次，棄上清，用300 μL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.4免疫熒光染色觀察線粒體轉(zhuǎn)移以10 μmol/L終濃度的分子探針CFSE對PC12進(jìn)行染色標(biāo)記，以終濃度200 nmol/L分子探針MitoTracker Red對N1-iPSC-MSCs進(jìn)行染色標(biāo)記。分別消化收集2種細(xì)胞，以每種細(xì)胞每孔1×104接種于含多聚賴氨酸爬片的24孔板中進(jìn)行共培養(yǎng)。24 h后收集細(xì)胞爬片。PBS 洗3遍，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS洗3遍，DAPI染色后封片，置于熒光顯微鏡下觀察攝片。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SigmaPlot 12.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用單因素方差分析進(jìn)行多組比較，用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 CoCl2呈濃度依賴性地降低PC12細(xì)胞的存活率

CCK8-結(jié)果顯示隨著CoCl2濃度的增加，24 h后PC12細(xì)胞的存活率逐漸下降(P＜0.01)。200 μmol/L、400 μmol/L和600 μmol/L濃度CoCl2處理PC12細(xì)胞24 h后，PC12細(xì)胞的存活率分別為82.7%±9.2%、49.9%±9.0%和33.0%±9.7%。本實(shí)驗(yàn)選取400 μmol/L作為CoCl2的損傷濃度，見圖1。

Figure 1.The effect of different concentrations of CoCl2on viability of the PC12 cells.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group.圖1 CoCl2對PC12細(xì)胞存活率的影響

2 iPSC-MSCs對CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的抑制作用

FL1通道(GFP)陰性細(xì)胞群為PC12細(xì)胞，對其設(shè)門進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果顯示，使用400 μmol/L CoCl2處理PC12細(xì)胞24 h可使其凋亡率顯著增高達(dá)到34.6%±7.0%(P＜0.01)。在CoCl2處理PC12細(xì)胞后加入GFP-iPSC-MSCs與其共培養(yǎng)，能減輕CoCl2所誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，使其凋亡率下降至28.1%±2.0%。與400 μmol/L CoCl2處理組比較，差異顯著(P＜0.05)，說明iPSC-MSCs能抑制CoCl2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，見圖2。

3 iPSC-MSCs對抗CoCl2對PC12細(xì)胞線粒體膜電位的損傷

FL9通道(CellTrace Violet)陽性細(xì)胞群為PC12細(xì)胞，對其設(shè)門進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果顯示，使用400 μmol/L CoCl2處理PC12細(xì)胞24 h可使其膜電位高的細(xì)胞顯著減少，達(dá)56.2%±10.4% (P＜0.01)。在CoCl2處理PC12細(xì)胞后加入GFP-iPSCMSCs與其共培養(yǎng)可使PC12細(xì)胞中膜電位高的細(xì)胞比例恢復(fù)至72.7%±1.2%，與400 μmol/L CoCl2處理組比較，差異顯著(P＜0.01)。提示iPSC-MSCs可逆轉(zhuǎn)CoCl2所致的PC12細(xì)胞線粒體膜電位變化，見圖3。

4 iPSC-MSCs可以通過細(xì)胞間接觸向PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體

如圖4所示，CFSE標(biāo)記的PC12細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，MitoTracker Red標(biāo)記N1-iPSC-MSCs的線粒體使其呈紅色，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核呈藍(lán)色。共培養(yǎng)24 h后可見N1-iPSC-MSCs與PC12細(xì)胞之間形成很長的隧道納米管，在綠色熒光的PC12細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)了顆粒樣的紅色熒光，提示N1-iPSC-MSCs將部分線粒體轉(zhuǎn)移至PC12細(xì)胞中，見圖4。

討論

本文再次證實(shí)，化學(xué)性缺氧模擬劑CoCl2能使PC12細(xì)胞存活率降低，該作用呈劑量依賴性［6］。當(dāng)使用400 μmol/L CoCl2處理PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡增多，線粒體膜電位降低。這些結(jié)果均與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能減輕CoCl2所致的PC12細(xì)胞損傷［8］，我們在使用iPSC-MSCs與受損的PC12細(xì)胞共培養(yǎng)后觀察到了同樣的作用。

腦缺血缺氧損傷后細(xì)胞可通過線粒體凋亡通路、死亡受體通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路發(fā)生凋亡，而其中線粒體凋亡通路是主要途徑［9］。Bcl-2家族蛋白可對此凋亡過程進(jìn)行調(diào)控，而該調(diào)控過程與線粒體密不可分［10］。因此，線粒體在腦缺血缺氧損傷后的病理生理過程中處于重要地位，以恢復(fù)線粒體功能為靶目標(biāo)的治療也受到越來越多學(xué)者的關(guān)注［11］。

在體外實(shí)驗(yàn)中已有學(xué)者證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移線粒體到心肌細(xì)胞［5］、肺泡上皮細(xì)胞［12］、血管內(nèi)皮細(xì)胞［13］，使細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞氧化呼吸功能恢復(fù)，ATP生成增多。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們同樣也觀察到iPSC-MSCs可以與PC12細(xì)胞之間形成很長的TNTs，向PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體，使PC12細(xì)胞的線粒體膜電位恢復(fù)，凋亡減少。

Figure 2.iPSC-MSCs protected PC12 cells against CoCl2-induced apoptosis.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs CoCl2group.圖2 iPSC-MSCs抑制CoCl2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡

在本實(shí)驗(yàn)中，受損PC12細(xì)胞線粒體膜電位的恢復(fù)可能與iPSC-MSCs轉(zhuǎn)移正常的線粒體到其胞漿中，使JC-1的釋放減少有關(guān)。此外，轉(zhuǎn)移的線粒體可能可以為受損的PC12細(xì)胞提供ATP，恢復(fù)受損細(xì)胞的能量代謝，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡。

決定干細(xì)胞向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體的關(guān)鍵因素之一是2種細(xì)胞間可以形成連接通道供線粒體通過。在膿毒癥所致小鼠的急性肺損傷模型中，受損肺泡表達(dá)Cx43增多，促進(jìn)了干細(xì)胞在局部的滯留，肺泡上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞之間形成隧道納米管TNTs，繼而干細(xì)胞向肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體發(fā)揮保護(hù)作用［4］。在腦損傷時(shí)，Cx43的表達(dá)同樣是增高的［14］。據(jù)此我們可以推測，腦損傷時(shí)Cx43表達(dá)的增加也可以促進(jìn)干細(xì)胞在局部停留并與神經(jīng)元形成接觸，發(fā)揮干細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)移的保護(hù)作用。我們的合作者連其周教授課題組發(fā)現(xiàn)，相對于骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞而言，iPSC-MSCs轉(zhuǎn)移線粒體的效率更高，治療作用更強(qiáng)［15］。因此，相對于使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療腦損傷而言，iPSC-MSCs可能是一個(gè)更好的選擇。目前已有學(xué)者［16］通過修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞使其表達(dá)Miro1增高，提高線粒體轉(zhuǎn)移的效率和保護(hù)作用。Cx43也可能成為修飾iPSC-MSCs提高其轉(zhuǎn)移線粒體效率治療腦損傷的潛在靶點(diǎn)之一。

Figure 3.iPSC-MSCs recovered MMP of PC12 cells exposed to CoCl2.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs CoCl2group.圖3 iPSC-MSCs對抗CoCl2對PC12細(xì)胞線粒體膜電位的損傷

綜上所述，本研究首次證實(shí)iPSC-MSCs與PC12細(xì)胞間可以形成TNTs并轉(zhuǎn)移線粒體。這一作用可能是iPSC-MSCs恢復(fù)受損PC12細(xì)胞的線粒體膜電位，使其凋亡減少的機(jī)制之一。通過修飾iPSC-MSCs提高其線粒體轉(zhuǎn)移效率可能成為缺血缺氧性腦損傷治療研究的一個(gè)新的方向。

Figure 4.iPSC-MSCs transferred mitochondria to the PC12 cells.圖4 iPSC-MSCs通過TNTs轉(zhuǎn)移線粒體至PC12細(xì)胞

［參考文獻(xiàn)］

［1］Laver S，F(xiàn)arrow C，Turner D，et al.Mode of death after admission to an intensive care unit following cardiac arrest ［J］.Intensive Care Med，2004，30(11) :2126-2128.

［2］Doeppner TR，Hermann DM.Stem cell-based treatments against stroke: observations from human proof-of-concept studies and considerations regarding clinical applicability ［J］.Front Cell Neurosci，2014，8:357.

［3］Meier C，Rosenkranz K.Cx43 expression and function in the nervous system-implications for stem cell mediated regeneration［J］.Front Physiol，2014，5:106.

［4］Islam MN，Das SR，Emin MT，et al.Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury［J］.Nat Med，2012，18(5) :759-765.

［5］Plotnikov EY，Khryapenkova TG，Vasileva AK，et al.Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture［J］.J Cell Mol Med，2008，12(5A) :1622-1631.

［6］Lee M，Kang H，Jang SW.CoCl2induces PC12 cells apoptosis through p53 stability and regulating UNC5B［J］.Brain Res Bull，2013，96:19-27.

［7］廖新學(xué)，阮經(jīng)文，蘭愛平，等.p38 MAPK-iNOS-NO通路介導(dǎo)化學(xué)性缺氧對PC12細(xì)胞的損傷作用［J］.中國病理生理雜志，2010，26(12) :2410-2414.

［8］莫世靜，童秀珍，鐘茜，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過上調(diào)EPO表達(dá)減輕缺氧損傷引起的PC12細(xì)胞凋亡［J］.中國病理生理雜志，2013，29(1) :62-69.

［9］Niizuma K，Yoshioka H，Chen H，et al.Mitochondrial and apoptotic neuronal death signaling pathways in cerebral ischemia［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1802 (1) :92-99.

［10］Xing B，Chen H，Zhang M，et al.Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in the rat［J］.Stroke，2008，39(8) : 2362-2369.

［11］Gonzalez-Lima F，Barksdale BR，Rojas JC.Mitochondrial respiration as a target for neuroprotection and cognitive enhancement［J］.Biochem Pharmacol，2014，88(4) : 584-593.

［12］Spees JL，Olson SD，Whitney MJ，et al.Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(5) :1283-1288.

［13］Liu K，Ji K，Guo L，et al.Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer［J］.Microvasc Res，2014，92: 10-18.

［14］Rami A，Volkmann T，Winckler J.Effective reduction of neuronal death by inhibiting gap junctional intercellular communication in a rodent model of global transient cerebral ischemia［J］.Exp Neurol，2001，170(2) :297-304.

［15］Li X，Zhang Y，Yeung SC，et al.Mitochondrial transfer of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells to airway epithelial cells attenuates cigarette smokeinduced damage［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2014，51(3) :455-465.

［16］Ahmad T，Mukherjee S，Pattnaik B，et al.Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport＆enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy［J］.EMBO J，2014，33(9) :994-1010.

通訊作者△Tel: 020-87755766; E-mail: xlidoct@ qq.com

*［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81272062; No.81471832; No.81372022) ;廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2013010016799) ;廣東省科技計(jì)劃(No.2012B031800286) ;中山大學(xué)青年教師重點(diǎn)培育項(xiàng)目(No.13ykzd11)

［收稿日期］2014-12-26

［文章編號］1000-4718(2015)06-1036-06

［中圖分類號］363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.013