小鵝瘟病毒實驗室檢測方法研究進展

莊金秋+梅建國+莫玲+姚春陽+沈志強

中圖分類號：S858.335.3 ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ?文章編號：1673-1085（2014）05-0040-05

小鵝瘟（Gosling plague，GP）又稱為鵝細小病毒病，是由細小病毒科細小病毒屬的鵝細小病毒 （Goose parvovirus，GPV）引起的一種急性或亞急性、高度接觸性、敗血性傳染病。該病主要以嚴重下痢、滲出性腸炎和腸道栓塞為特征。發(fā)病雛鵝常表現(xiàn)為出血性、纖維素性及滲出性腸炎，最后形成腸內(nèi)栓塞。該病主要發(fā)生于1月齡以內(nèi)雛鵝和雛番鴨，具有傳播快、發(fā)病率和死亡率高的特點，死亡率可高達90%以上。隨著雛鵝日齡的增長，其發(fā)病率和死亡率呈下降趨勢。我國學者方定一于1956年首次報道該病，并成功分離到GPV。該病長期以來在我國乃至全世界鵝群中廣泛流行，是目前危害養(yǎng)鵝業(yè)的主要傳染病之一，常給養(yǎng)鵝業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。一般認為，小鵝瘟根據(jù)流行病學、臨床特征和剖檢特點，可以做出初步診斷，但是確診本病需要進行實驗室診斷。本病暴發(fā)的主要原因是呈亞臨床感染或隱性感染者的鵝排毒污染種蛋及環(huán)境，從而將病毒傳給易感雛鵝。因此，做好該病的預防控制，特別是快速而準確的診斷方法的建立受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。本文就我國在GPV檢測技術(shù)研究進展方面作一綜述，以期對小鵝瘟的深入研究和疾病防控提供參考。

1 ?病毒分離鑒定

GPV能在鵝胚、番鴨胚或其原代細胞培養(yǎng)物以及Marc-145細胞中增殖并形成細胞病變（CPE），但不能在PK15和CEF等細胞中生長。將病料接種在未長滿單層的鵝胚或番鴨胚原代細胞培養(yǎng)物中，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞單層感染病毒后3～5d出現(xiàn)明顯CPE，表現(xiàn)為細胞折光性增強、圓縮直至溶解脫落等。將細胞培養(yǎng)物經(jīng)蘇木素-伊紅染色后可見CowdryA型核內(nèi)包涵體與合胞體的存在[1]。將收集的死亡鵝胚、番鴨胚尿囊液或細胞培養(yǎng)物經(jīng)磷鎢酸負染后進行電鏡觀察，根據(jù)病毒大小、形態(tài)等典型的細小病毒特征可進行鑒定。

2 ?血清學檢測

2.1 ?酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） ?朱少璇等[2]（1989）應用抗GPV單抗對鵝胚初次分離毒用間接ELISA法進行鑒定。李永峰[3]（2010）以純化的GPV重組VP3蛋白為包被抗原，建立了檢測雛番鴨水禽細小病毒抗體的間接ELISA方法，經(jīng)初步應用于血清中水禽細小病毒抗體的檢測，其敏感性高于瓊脂擴散試驗，與中和試驗結(jié)果基本一致，符合率為84%。尚緒增等[4]（2010）也建立了檢測GPV的間接ELISA方法，表達了GPV重組NS2蛋白。秦愛建等[5]（1990）建立了GPV單抗免疫酶斑點試驗，對提純GPV最小檢出病毒蛋白量為0.17ng/ml。李新華[6]（1998）應用辣根過氧化物酶（HRP）標記單抗對GPV強毒致死的雛鵝和番鴨的組織勻漿上清液進行了斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗，其敏感度達到8.5ng/ml，檢測時間3h，非常適用于大批量樣品的快速檢測。廖德惠等[7]（1994）用純化的GPV抗原，制備兔抗GPV血清，應用斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（Dot-ELISA）能檢出少至4.883ng/mg的GPV抗原。龔建森等[8]（2008）建立了雙抗體夾心ELISA方法檢測GPV。布日額等[9]（2009）利用 GPV VP1～VP3非重疊序列重組原核表達多肽為檢測抗原，建立了檢測鵝抗體的ELISA和Dot-ELISA方法，并對弱毒疫苗的免疫效果進行了檢測，兩種方法的檢測結(jié)果基本一致。杜秋明等[10]（2011）建立了檢測GPV的單抗雙夾心ELISA方法，對GPV檢測靈敏度達0.312mg/L。用該法對延邊某養(yǎng)鵝場疑似發(fā)生小鵝瘟病的252只病死鵝進行檢測，結(jié)果陽性率為75.79%，與病毒中和試驗方法的檢測結(jié)果符合率達91.11%，為GPV的檢測和區(qū)域流行病學調(diào)查提供了一種簡便快速的血清學方法。三種ELISA方法進行比較發(fā)現(xiàn)，能夠直接檢測病料的是斑點酶聯(lián)免疫吸附，而間接ELISA和雙抗體夾心ELISA檢測需要對病毒進行分離，病毒分離至少需要5d，有的甚至初次分離不出病毒，需要連續(xù)傳代2～3次，試驗時間較長，不能滿足臨床快速診斷小鵝瘟的需要。鄒叔和等[11]（1992）報道了用生物素-親和素（ABC）系統(tǒng)的復合物-酶聯(lián)免疫吸附試驗（ABC-ELISA）檢測GPV的研究，其對提純的GPV DNA最小檢出量為0.1g，該方法很敏感，但操作繁瑣且復雜。

2.2 ?瓊脂免疫擴散試驗（AGP） ?AGP方法操作簡便、經(jīng)典快速，適于基層推廣和應用，但靈敏度不高，需要高效價抗血清及多倍濃縮的尿囊液進行GPV的檢測。李侯寶等[12]（1987）、余永建等[13]（1987）、洪鋒等[14]（1989）、王新海[15]（1990）、秦愛建等[16]（1993）、湯明等[17]（1994）、霍峰等[18]（2000）先后報道了應用AGP檢測GPV的研究。陳天祥[19]（1990）報道了應用該方法檢測GPV卵黃抗體水平的研究。AGP方法非常適用于GPV感染的臨床診斷及免疫鵝抗體水平的監(jiān)測。

2.3 ?反向間接血凝試驗 ?徐為燕等[20]（1981）、孫懷昌等[21]（1989）建立了反向間接血凝試驗的方法檢測鵝胚尿囊液中的GPV。郭玉璞等[22]（1994）對此法做了進一步完善，對病料中GPV的檢測靈敏度能達到24ng/ml。人工感染的鵝胚尿囊液、人工感染發(fā)病鵝肝組織及其糞樣中的GPV檢出率分別為100%、81%和99%。該方法對小鵝瘟可疑病例3h內(nèi)即可做出診斷，有很好的實用價值，但敏感性差，易受到非特異性因素的影響，降低試驗的準確性。

2.4 ?膠乳凝集試驗（LAP） ?朱小麗等[23]（2012）采用GPV單抗標記聚苯乙烯膠乳，建立了檢測GPV抗原的LPA方法。對人工感染病例的LPA檢測結(jié)果與PCR符合率為93.3%;對臨床18份疑似GPV病例進行檢測，LPA和PCR符合率為94.5%。表明LPA具有簡便、快速、特異、準確等優(yōu)點，適用于基層快速診斷小鵝瘟病。

2.5 ?病毒中和試驗（VN） ?GPV與相應的抗體結(jié)合后，會失去對易感鵝的致病力。此方法可在鵝胚及其成纖維細胞上進行。趙坤等[24]（2000）、張耀成等[25]（2001）以鵝胚及其成纖維細胞建立此法檢測GPV抗原，結(jié)果不僅重復性好，敏感性高，還易于操作，但檢測時間較長，不適于大量病料組織的快速檢測。

2.6 ?免疫熒光（IF）抗體技術(shù) ?潘玉民等[26]（1990）應用GPV高免鵝血清提取IgG標記異硫氰酸熒光素（FITC）建立直接免疫熒光法用于檢測鵝體內(nèi)的GPV抗原，該方法可直接檢出病料組織中的GPV，但不能克服番鴨細小病毒（MPV）與GPV在血清學上的交叉性。邱平等[27]（1996）也有報道應用FITC標記抗鵝源GPV的特異性單抗，建立免疫熒光技術(shù)檢測鵝源GPV，該方法敏感性好，檢出率較高，2h內(nèi)可檢測出GPV抗原。鄭大恒等[28]（2003）用兔抗GPV高免血清，提取IgG標記FITC建立直接免疫熒光法用于檢測鵝體內(nèi)的GPV抗原，該方法雖然簡便快捷，但仍不能區(qū)分MPV和GPV。朱小麗等[29]（2012）將抗番鴨GPV單抗腹水采用透析法標記FITC，制備成抗GPV熒光抗體，研制了檢測GPV抗原的直接免疫熒光方法。蔡羲等[30]（2009）用抗番鴨GPV雜交瘤細胞上清和單抗作為一抗，檢測GPV取得良好的效果。呂雪峰等[31]（2012）利用制備的熒光抗體，建立了較為高效的檢測GPV的直接免疫熒光法，表明其所制備出的鵝IgG熒光抗體敏感性較高、特異性較強。郭卉等[32]（2013）建立了檢測GPV的間接免疫熒光方法（IFA），該方法不僅能夠檢測鵝胚成纖維細胞中的GPV，還能夠檢測發(fā)病鵝組織冰凍切片中的GPV。為今后GPV細胞活疫苗的檢測評價和臨床診斷提供了技術(shù)手段。免疫熒光抗體技術(shù)重復性和穩(wěn)定性良好，具有較強的特異性和敏感性，而且操作簡便、快速，但需要特殊的儀器，不適合基層推廣。

2.7 ?膠體金免疫層析（GICA）技術(shù) ?該方法是基于單克隆抗體建立的診斷技術(shù)。李長瑜等[33]（2007）報道了GPV膠體金層析檢測卡的研究，雖然該方法的特異性強，靈敏度高，但是該方法需要對病原進行分離后，取鵝胚或者番鴨胚尿囊液或細胞培養(yǎng)物進行檢測，病原分離和檢測至少需要5d，不適合在臨床上快速檢測應用。

2.8 ?對流免疫電泳技術(shù) ?謝曼琳等[34]（1990）建立了檢測GPV的對流免疫電泳試驗方法，對GPV的檢出率高達94.1%，整個過程只需3h，比AGP快4倍，有利于小鵝瘟的早期確診。本方法雖然具有快速、敏感、特異性強等特點，但容易受到非特異性因素的影響，降低試驗結(jié)果的準確性。

3 ?分子生物學檢測

3.1 ?PCR技術(shù) ?目前我國多家研究機構(gòu)均建立了GPV的PCR快速檢測方法，在臨床小鵝瘟病例的診斷中取得了良好的效果。布日額等[35]（2003）、胡桂學等[36]（2003）、黃誠等[37]（2004）、姚笛等[38]（2006）、李福偉等[39]（2006）、劉家森等[40]（2007）、邵洪澤等[41]（2009）、李文學等[42]（2010）、王倩等[43]（2012）、趙磊等[44]（2013）建立了檢測GPV的單重PCR方法，趙研等[45]（2007）、王暖成等[46]（2010）、王靜雅[47]（2012）建立了雙重套式PCR方法。董浩等[48]（2011）建立了能對石蠟切片中GPV核酸進行定位的原位PCR方法，為GPV在鵝體內(nèi)的定位、致病機理研究等提供有效的試驗手段。熒光定量PCR方法檢測GPV具有更高的特異性和敏感性。畢建敏等[49]（2008）將Real-time PCR成功應用于GPV的檢測。龍朕等[50]（2010）、董浩等[51]（2011）建立了GPV的Taq Man熒光定量PCR檢測方法。饒桂波[52]（2013）研究建立的PCR-DHPLC檢測方法陽性檢出率達100%，是一種新的檢測GPV的方法。該方法能夠特異性檢測病料組織中GPV，為臨床GPV的感染提供了有效的檢測手段。

3.2 ?環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術(shù) ?尚毅等[53]（2011）、金文杰等[54]（2012）建立了LAMP技術(shù)應用于GPV的快速診斷，縮短了檢測時間。傅秋玲等[55]（2013）針對GPV VP3基因的8個位點設計了6條特異性引物，也建立了快速檢測GPV的LAMP方法。該方法靈敏、特異、實用、快速，非常適合基層及現(xiàn)場快速檢測。研究首次采用鈣黃綠素代替SYBR Green染料作為GPV LAMP檢測方法的指示劑，解決了采用SYBR Green染料作為指示劑造成假陽性的技術(shù)難題，使得LAMP方法在臨床檢驗上具有更廣闊的應用前景，為臨床檢測提供了一種新方法。

3.3 ?核酸探針技術(shù) ?核酸探針技術(shù)是一種極其敏感的分子生物學方法，具有pg水平的檢測靈敏度。該方法檢測GPV不僅僅快速、準確、操作簡便、成本低，還可反復長期使用，從根本上減少甚至避免了抗原的多樣性和易變性而引起的交叉反應和非特異性反應。段玉友等[56]（1993）、余兵等[57]（2002）、布日額等[58，59]（2004和2005）以地高辛標記成核酸探針，并運用該探針初步建立了檢測病料中GPV核酸的斑點雜交法。該方法特異性、敏感性和適用性都很強，但其技術(shù)性要求較強，操作繁瑣，且檢測成本較高，不適宜臨床上的推廣與應用。

4 ?存在的問題與展望

小鵝瘟是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病，一旦發(fā)病將造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，建立快速、敏感、特異的GPV檢測方法，加強該病的流行監(jiān)測，掌握該病的流行趨勢及該病毒分子遺傳變異的規(guī)律，是該病臨床診斷、防疫與檢疫的迫切要求，將有助于降低該病在家禽的流行，并促進研制有效防控該病的疫苗。目前針對該病毒已建立了多種檢測方法，這些方法的使用極大地方便了該病的及早診斷，使得疫情得以有效控制。然而這些方法各自存在不同的優(yōu)缺點或苛刻要求，如有的存在操作繁瑣、受檢測材料限制，有的試驗周期較長，有的對試驗儀器及檢測人員技術(shù)要求高等，這就需要實驗室檢測人員根據(jù)各自條件，綜合選擇并建立合適的檢測方法，及時、準確、快速地監(jiān)測疾病的發(fā)生、發(fā)展和流行，并提供有效的防控措施。另外，隨著分子生物學的發(fā)展和人們對GPV研究的不斷深入，相信不久的將來，更多更為高效、敏感、特異、快速、簡易而且價廉的檢測方法將會被建立起來。

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