秦皇島市替加環(huán)素對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌體外抗菌活性研究

張曉玲 霍麗靜 劉鵬 彭宗生

肺炎克雷伯菌是一種重要的醫(yī)院內(nèi)感染病原體，隨著高產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的菌株占致病菌的比例逐年增高，作為應對該類細菌致嚴重感染的碳青霉烯類抗生素的臨床使用也不斷增多，催生出更多的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株，給臨床抗感染治療帶來極大的挑戰(zhàn)。替加環(huán)素作為新一代超廣譜抗生素，于2005年6月得到美國食品和藥品管理局(FDA)批準用于治療成人復雜腹腔內(nèi)感染和復雜的皮膚及軟組織感染，是第一個被批準應用于臨床的甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物。替加環(huán)素的作用機制主要是通過與核糖體30S亞基結合從而抑制蛋白質(zhì)的合成［1］。體外藥敏結果顯示對甲氧西林耐藥葡萄球菌、青霉素耐藥肺炎鏈球菌、萬古霉素耐藥腸球菌及多數(shù)革蘭陰性桿菌具良好的抗菌活性。是目前少數(shù)對耐碳青霉烯類菌株有抗菌活性的抗菌藥物之一。隨著替加環(huán)素在臨床使用的增加，需要快速、準確的藥敏結果指導臨床合理使用該類抗菌藥物。為了解其對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外抗菌活性，本研究回顧性收集秦皇島地區(qū)三所大型醫(yī)院2012年1月至2013年6月臨床分離出的49株亞胺培南或美羅培南耐藥的肺炎克雷伯菌，采用CLSI推薦的檢測MIC的參考方法瓊脂稀釋法檢測替加環(huán)素的MIC值，以了解秦皇島地區(qū)替加環(huán)素對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外藥物敏感性，為該藥在臨床上的使用提供體外藥物檢測依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集港口醫(yī)院、秦皇島市第三醫(yī)院和秦皇島市北戴河醫(yī)院2012至2013年臨床分離的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌共49株，1個患者只收集一次菌株，以保證菌株的不重復性。并記錄患者的科室，病種，年齡等基本情況。按照CLSI 2011年M100-S21中折點判定標準厄它培南 MIC≥0.5 mg/L，美羅培南MIC≥2.0 mg/L或亞胺培南 MIC≥2.0 mg/L，判定為耐碳青酶烯類藥物菌株。

1.2 抗菌藥物及培養(yǎng)基 抗菌藥物標準品:替加環(huán)素標準粉(美國輝瑞制藥有限公司，批號:L28832-6)儲存于≤20℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融。美羅培南(住友制藥)，亞胺培南(杭州默沙東制藥有限公司)，厄他培南(杭州默沙東制藥有限公司)。試驗培養(yǎng)基為Mueller-Hinton瓊脂(美國Oxoid公司)。

1.3 方法 MIC值測定:藥敏試驗嚴格按照2009年《新型甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物替加環(huán)素的體外藥敏試驗操作規(guī)程》［2］及CLSI推薦的瓊脂稀釋法測定替加環(huán)素對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的MIC值。根據(jù)《替加環(huán)素體外藥敏試驗操作規(guī)程專家共識》［3］，隔夜存放的M-H瓊脂會使檢測結果升高。本研究使用的M-H瓊脂均為當天新鮮配制。另外由于替加環(huán)素含多酚基團，理化性質(zhì)活潑，易氧化降解或形成差向異構體，在光線及空氣中久置會導致替加環(huán)素有效抗菌活性降低，影響檢測結果。所以試驗中配制M-H瓊脂稀釋的藥物原液和稀釋的過程要嚴格避光，盡量減少與空氣解觸的時間(黑布遮蓋，加蓋)。稀釋好的不同濃度的含替加環(huán)素的M-H培養(yǎng)基加橡膠塞密封置于培養(yǎng)箱中24 h觀察結果。為保證結果的準確性同時用瓊脂稀釋法做質(zhì)控菌的MIC值，質(zhì)控菌結果在CLSI規(guī)定范圍內(nèi)，才可統(tǒng)計結果。

1.4 質(zhì)控范圍和折點判定 目前CLSI沒有替加環(huán)素的藥敏結果判定標準，只給出了替加環(huán)素藥敏試驗中質(zhì)控菌株可接受的質(zhì)量控制范圍。本研究中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌應用大腸埃希菌ATCC25922的質(zhì)控范圍0.03 ～0.25 mg/L。另外，由于 CLSI中尚無替加環(huán)素的MIC及折點判定標準，根據(jù)《替加環(huán)素體外藥敏試驗操作規(guī)程專家共識》，本研究中替加環(huán)素的折點采用FDA的折點判定標準:MIC≤2 mg/L為敏感，MIC≥8 mg/L為耐藥，MIC=4 mg/L為中介。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用WHONET 5.6軟件，建立藥敏結果數(shù)據(jù)庫并進行藥敏結果數(shù)據(jù)分析。

2 結果

2.1 49株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外藥敏結果 49株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌中，對替加環(huán)素敏感共45株占92.0%，中介共4株占8.0%，耐藥共0株。可見替加環(huán)素對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌具備較高的體外抗菌活性。見表1。

表1 替加環(huán)素對49株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外藥敏結果

2.2 49株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的體外敏感率分布。MIC為2 mg/L時，敏感率達92.0%，MIC 為 4 mg/L，敏感率達 100%。MIC50為1 mg/L，MIC90為2 mg/L，具有較好的體外敏感率。見表2。

表2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的體外敏感率分布 %

3 討論

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院內(nèi)和社區(qū)獲得性感染的重要腸桿菌科細菌。碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌感染最重要的抗菌藥物。近年來，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，一些地區(qū)革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥現(xiàn)象顯著增加。其中，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌占相當比例。自2001年在美國發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒介導的KPC-1型碳青霉烯酶以來，世界各地陸續(xù)檢出了產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。我國于2007年報道浙江省檢出產(chǎn)KPC-2型酶肺炎克雷伯菌。近年，細菌耐藥檢測網(wǎng)統(tǒng)計中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的比例逐年增多，引起了普遍關注。已有研究表明［4］，碳青霉烯類抗生素耐藥主要機制是菌株產(chǎn)生碳青霉烯類水解酶。肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制復雜，可與碳青霉烯酶產(chǎn)生、質(zhì)粒型AmpC酶的過度表達合并外膜孔蛋白的丟失、碳青霉烯類高親和位點PBP2的數(shù)量下降、缺失或親和力下降等機制有關。肺炎克雷伯菌產(chǎn)酶基因的多樣性及其并存和表達，給臨床治療耐藥菌感染帶來了極大的挑戰(zhàn)［4］。

替加環(huán)素作為一種半合成的四環(huán)素類藥物，在米諾環(huán)素9位分子上添加叔丁基甘氨肽氨基團而衍生的一種新型四環(huán)素類抗生素。由于9位替代基團形成的空間位阻作用，使其與核糖體靶位的親和性比米諾環(huán)素和四環(huán)素高5倍以上，且細菌對其不易產(chǎn)生耐藥性［5］。替加環(huán)素不能激活四環(huán)素外排蛋白，因此微生物外排泵無法將甘氨酰四環(huán)素類藥物排至胞外。正是由于它克服了獲得性的核糖體保護tet(M)和主動外排tet(A-E)這兩個臨床上產(chǎn)生耐藥性的機制，從而使細菌對替加環(huán)素產(chǎn)生顯著耐藥性的可能性很小，只有及其顯著的突變才有可能導致細菌對替加環(huán)素的耐藥。因而替加環(huán)素目前被認為是一種具有高效而廣譜的抗菌活性的抗生素。

本研究檢測2012至2013年秦皇島三所大型醫(yī)院203例肺炎克雷伯菌，其中49例為耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌占24%。對菌株來源進行統(tǒng)計，其中來源于ICU的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌為19例占38.8%，來源于呼吸科的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌為21例占42.9%，另外腫瘤患者合并肺部感染3例、外傷手術后感染患2例、菌血癥2例、腹膜炎1例、重度糖尿病1例。可見來源于ICU和呼吸科的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌占相當大比例，為81.6%。秦皇島地區(qū)的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌流行趨勢不容樂觀，給臨床選擇用藥帶來了極大的困難。

本研究顯示，替加環(huán)素對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌表現(xiàn)出良好的體外抗菌活性，對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外敏感率可達92.0%，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素未表現(xiàn)有耐藥株。由于該藥在臨床用藥方便及與其他藥物無交叉耐藥，且肝腎毒性低等特點，使其在臨床抗感染治療中具有非常樂觀的前景，因此替加環(huán)素可首選用于臨床耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌引起感染的治療。同時，做好替加環(huán)素的體外藥敏監(jiān)測，為臨床科學、合理、高效的使用此藥提供支持，為醫(yī)院感染控制提供確切的依據(jù)，是臨床細菌工作者需要做的一項重要工作。

1 杜小幸，王海萍，傅鷹，等.不同藥敏方法檢測替加環(huán)素對鮑曼不動桿菌敏感性的比較.中華檢驗醫(yī)學雜志，2013，36:598-599.

2 王輝，倪語星，陳民鈞，等.新型甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物替加環(huán)素的體外藥敏試驗操作規(guī)程.中華檢驗醫(yī)學雜志，2009，32:1208-1213.

3 王輝，俞云松，王明貴，等.替加環(huán)素體外藥敏試驗操作規(guī)程專家共識.中華檢驗醫(yī)學雜志，2013，36:584-587.

4 楊麗君，陳堅，楊燕，等.碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌基因型檢測和同源性分析.中華檢驗醫(yī)學雜志，2013，36:318-323.