益母草與馬齒莧配伍對早孕大鼠不完全流產(chǎn)子宮出血的影響

董自波，李 超△，洪 敏，

(1.濟川藥業(yè)集團有限公司，江蘇泰興 225400;2.南京中醫(yī)藥大學，南京 210046)

益母草與馬齒莧配伍對早孕大鼠不完全流產(chǎn)子宮出血的影響

董自波1，李 超1△，洪 敏2，

(1.濟川藥業(yè)集團有限公司，江蘇泰興 225400;2.南京中醫(yī)藥大學，南京 210046)

目的:觀察益母草與馬齒莧配伍對早孕不完全流產(chǎn)大鼠的出血量、血液流變學、部分激素水平及子宮雌激素受體和孕激素受體表達的影響。方法:應用米非司酮和米索前列醇造成早孕大鼠不完全流產(chǎn)子宮出血模型，觀察藥物對出血量、血液流變性的影響，檢測子宮勻漿液中ET和NO的含量及放免法檢測血液激素水平和免疫組化法觀察子宮雌激素受體、孕激素受體表達的變化，研究藥物對子宮出血模型大鼠的效應及機制。結果:益母草與馬齒莧配伍可減少子宮NO分泌，提高局部TGF-β水平，減少子宮出血量。結論:益母草與馬齒莧配伍能明顯緩解米非司酮和米索前列醇導致的早孕大鼠出血癥狀。

藥物流產(chǎn);放免法;免疫組化法;血液流變性

益母草與馬齒莧配伍是臨床用于治療功血的經(jīng)驗方。功能失調(diào)性子宮出血(dysfunctional uterine bleeding，DUB)簡稱功血，系指由于下丘腦-垂體-卵巢軸功能失調(diào)，而非生殖道器質(zhì)性病變所引起的、以月經(jīng)失調(diào)為特征的異常性子宮出血。本研究應用米非司酮和米索前列醇制備大鼠不完全流產(chǎn)模型，研究益母草與馬齒莧配伍對該模型與功能性子宮出血相關的內(nèi)分泌功能、血液流變學的相關變化影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康SD清潔級大鼠，雌性體質(zhì)量220～250 g，雄性體質(zhì)量250～300 g，購自河南省實驗動物中心(合格證號SCXK(豫)2005-0001)。

1.2 受試藥物

益母草與馬齒莧配伍浸膏，江蘇濟川制藥有限公司提供(批號101204)。臨用前以蒸餾水配制到所需濃度，大鼠低、中、高劑量分別為0.54 g浸膏/ kg、1.08 g浸膏/kg、2.16 g浸膏/kg。

1.3 藥品及試劑

宮血寧膠囊(云南白藥集團股份有限公司，批號20090908)、米非司酮片(浙江仙居制藥股份有限公司，批號090401)、米索前列醇片(北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號430701094)、阿司匹林(南京制藥廠，批號990418)、二甲苯(上海久億化學試劑有限公司，批號20060101)、地塞米松(鄭州卓峰制藥廠，批號9031641)、縮宮素注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號080705)、水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠，批號20081206)、肝素鈉(北京索萊寶科技有限公司)、36%乙酸(南京化學試劑廠)、ET放免試劑盒(購于北京北方生物技術研究所)、TGF-β1 ELISA 試劑盒(RAT-TGFβ1ELISA KIT，LOT: E09E0709)、考馬斯亮藍(購于南京建成生物工程研究所)。

1.4 儀器

普通顯微鏡;電子分析天平(上海精密儀器有限公司);DK-600型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司);Z-323臺式離心機(德國 TM公司);Spectra Max 190酶標儀(美國AD公司);LG-R-808血液流變分析儀(北京中勤世帝科學儀器有限公司);熒光多功能顯微鏡(BX60，日本OLYMPUS公司);圖像獲取系統(tǒng)(DP71，日本 OLYMPUS公司);形態(tài)圖像分析軟件(南京大學捷達公司);石蠟切片機(RM2145，德國LEICA公司);全自動組織儀(TP1020，德國LEICA公司);切片漂烘溫控儀(QPB，安徽電子科學研究所);γ放射免疫計數(shù)器(GC-1200，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

2 方法

2.1 模型的建立［1］

大鼠于下午16時進行陰道涂片檢查，將其按發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期、間期分籠，于18時將發(fā)情前期與發(fā)情期大鼠按2∶1與雄性大鼠合籠，次日早晨8時陰道涂片觀察，以發(fā)現(xiàn)精子為妊娠第1天。于第7天分別灌胃米非司酮(8∶00)和米索前列醇(18∶00)，同時于陰道內(nèi)置入定量棉球1個(棉球重70～80 mg，用塑料薄膜包裹半側，以防血液漏出和尿液返流)。次日分別于8∶00和18∶00將棉球取出，放入塑料袋中密閉冷藏保存，同時置換1個新棉球于陰道內(nèi)，觀察陰道出血情況，連續(xù)至第14天處死動物，將收集的每鼠陰道棉球進行出血量測定。

2.2 分組與給藥

將妊娠大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、益母草與馬齒莧配伍(0.54 g浸膏/kg、1.08 g浸膏/kg、2.16 g浸膏/kg)組、宮血寧膠囊組，取未妊娠雌性大鼠作為空白對照組。造模成功后，次日(第8天)益母草與馬齒莧配伍(0.54 g浸膏/kg、1.08 g浸膏/ kg、2.16 g浸膏/kg)組、宮血寧膠囊組(0.0702 g/ kg)均10 mL/kg灌胃給藥，空白對照組、模型組分別灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。用藥結束后(妊娠第15天)每組頸總動脈取血檢測血流變，取子宮進行其他指標測定。

2.3 出血量的測定［1～4］

取頸總動脈血0.02 mL，加入50 g·L－1NaOH溶液4 mL中混勻待用。將收集的每只老鼠子宮出血棉球分別置于燒杯內(nèi)，根據(jù)出血量的情況加適量50 g· L－1NaOH浸泡擠壓搓洗棉球血漬，浸洗后的溶液倒入另一燒杯內(nèi)保存。再加入適量50 g·L－1NaOH浸泡棉球，擠壓搓洗血漬倒入容器保存。根據(jù)棉球血漬洗脫情況，決定是否再浸洗1～2次。將先后所有浸提液混勻，記錄所用50 g·L－1NaOH總量，取5 mL浸提液過濾，分別將已過濾的浸提液4 mL、大鼠尾靜脈血50 g·L－1NaOH溶液4 mL、以50 g·L－1NaOH為空白對照，在546 nm波長記錄吸光度(A)值。

計算公式:子宮出血量(mL)=［尾靜脈血量(0.02 mL)×子宮內(nèi)浸提液A值×V2］/尾靜脈血A值×V1。V1=稀釋尾靜脈血所用50 g·L－1NaOH量(4 mL)，V2=浸提子宮血所用50·L－1NaOH量(mL)。

2.4 模型大鼠血液流變性測定［5］

將100 μL 0.1%的肝素鈉加入試管，使其均勻涂過試管內(nèi)壁，然后80℃烘干備用。動物用5%的水合氯醛麻醉，取頸總動脈血5 mL置于實驗前準備的抗凝血試管中，輕輕搖勻，用血液流變分析儀測定全血黏度值(200 s－1，30 s－1，5 s－1，1 s－1)、血漿黏度值(100 s－1)、紅細胞聚集指數(shù)等血液流變學指標。

2.5 子宮內(nèi)膜勻漿NO含量測定

Griess試劑配制:配制2%對氨基苯磺酸、0.2%奈乙二胺、5%磷酸，按5∶5∶0.25比例混勻即得Griess試劑。分別取子宮組織200 mg，用冰冷的生理鹽水沖洗除去血液，濾紙拭下，用眼科剪剪碎，以冰鹽水在冰浴下研磨20%子宮組織勻漿，以3500 r/ min低溫離心15 min，取上清液，用Griess法檢測NO的含量。Griess試劑和上清液按1∶1混勻后550 nm下檢測吸光度，帶入標準曲線計算NO含量。

2.6 子宮內(nèi)膜勻漿TGF-β含量測定

取實驗2.5同法制得的子宮勻漿上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測。

2.7 血漿ET含量檢測

頸動脈取血5 mL，置2.4同法制得的肝素鈉離心管中，3000 r/min離心15 min取血漿，置－20℃保存。采用放射免疫分析法檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 益母草與馬齒莧配伍對模型大鼠子宮出血量的影響

表1顯示，按照上述方法造模給藥并檢測子宮出血量。結果顯示(空白組大鼠未見出血，故表中未列出)，模型大鼠有一定的出血量(0.442±0.269 mL)，益母草與馬齒莧配伍各劑量組可以使模型大鼠子宮出血量顯著減少。

表1 益母草與馬齒莧配伍對大鼠子宮出血模型出血量的影響(±s)

表1 益母草與馬齒莧配伍對大鼠子宮出血模型出血量的影響(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 劑量(g/kg)動物數(shù)(只)子宮出血量(mL) 10 0.442±0.269宮 血 寧 組 0.0702 12 0.099±0.063＊＊益母草與馬齒莧配伍 0.5400 12 0.213±0.147*1.0800 12 0.124±0.077＊＊2.1600 12 0.075±0.058模型組＊＊

3.2 藥物對模型大鼠血液流變性的影響

造模給藥方法同上，實驗結束頸總動脈取血，肝素抗凝，用血液流變儀檢測模型大鼠血液流變性。表2顯示，2.16 g/kg劑量組在200 s－1切變率下有增加全血黏度的作用，其余各劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，提示益母草與馬齒莧配伍有輕微改變模型大鼠血液流變性的作用。

表2 益母草與馬齒莧配伍對大鼠子宮出血模型血液流變性的影響(±s)

表2 益母草與馬齒莧配伍對大鼠子宮出血模型血液流變性的影響(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05

組別 例數(shù) 劑量(g/kg)全血黏度(mPa·s)紅細胞聚集指數(shù)空 白 對 照 12 — 3.95±0.70 5.26±1.21 10.06±2.41 23.25± 8.53 2 200 s－1 30 s－1 5 s－1 1 s－1血漿黏度(mPa·s)100 s－1.07±0.85 6.00±0.49模 型 組 12 — 3.74±0.6700 5.30±0.90 9.78±1.89 22.51± 4.83 2.57±1.41 6.02±0.99宮 血 寧 組 12 0.0702 3.78±1.11 5.35±1.76 10.13±3.94 24.99±11.16 2.70±1.02 6.15±1.16益母草與馬齒莧配伍 12 0.6700 3.81±0.93 5.35±1.55 10.59±2.85 27.74± 7.99 1.68±0.57 6.52±1.29 1.3500 3.48±0.59 4.84±0.73 8.95±1.22 21.77± 3.35 1.86±1.05 5.94±0.57 2.7000 4.25±0.52* 5.57±1.10 10.28±2.35 24.32±11.11 2.68±1.396.31±0.84

3.3 益母草與馬齒莧配伍對子宮內(nèi)膜勻漿NO含量的影響

表3顯示，取子宮內(nèi)膜勻漿測定其NO含量，結果可見，益母草與馬齒莧配伍2.16 g/kg劑量組與模型組比較，能明顯減少NO含量(P＜0.05)，說明益母草與馬齒莧配伍能減少子宮內(nèi)膜NO產(chǎn)生。

表3 益母草與馬齒莧配伍對模型大鼠子宮內(nèi)膜勻漿NO含量的影響(±s)

表3 益母草與馬齒莧配伍對模型大鼠子宮內(nèi)膜勻漿NO含量的影響(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05 vs

組別 劑量(g/kg)動物數(shù)(只) NO含量(umol/L)空 白 對 照 組 —10 34.61±10.87模 型 組 — 12 46.26±27.61宮 血 寧 組 0.0702 12 39.52±28.77益母草與馬齒莧配伍 0.5400 12 40.40±12.91 1.0800 12 35.74±5.33 2.1600 12 27.76±9.57*

3.4 益母草與馬齒莧配伍對子宮內(nèi)膜勻漿TGF-β含量的影響

表4顯示，藥物導致的流產(chǎn)會使TGF-β分泌減少。益母草與馬齒莧配伍2.16 g/kg組能升高子宮轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β水平，可見益母草與馬齒莧配伍可能通過提高TGF-β水平，從而促進修復子宮內(nèi)膜使其恢復正常生理狀態(tài)。

表4 益母草與馬齒莧配伍對不完全流產(chǎn)大鼠子宮TGF-β含量的影響(±s)

表4 益母草與馬齒莧配伍對不完全流產(chǎn)大鼠子宮TGF-β含量的影響(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05

組別 劑量(g/kg)動物數(shù)(只) TGF-β (pg/mL)空 白 對 照 組 —10 47.72±22.20模 型 組 — 12 35.49±26.58宮 血 寧 組 0.0702 12 41.54±27.19益母草與馬齒莧配伍 0.5400 12 27.29±20.38 1.0800 12 46.48±27.32 2.1600 12 61.91±25.07*

3.5 藥物對血漿內(nèi)皮素(ET)含量的影響

內(nèi)皮素是子宮血管的強烈收縮劑，促使子宮平滑肌和血管的收縮，能促使血管內(nèi)膜基底層小動脈收縮而有助于出血的停止。不完全流產(chǎn)大鼠血漿ET含量。表5顯示，模型大鼠ET水平比正常大鼠明顯升高，提示流產(chǎn)大鼠第7天時已啟動自身止血機制。益母草與馬齒莧配伍3個劑量組對流產(chǎn)大鼠血漿ET水平未見顯著影響。

表5 益母草與馬齒莧配伍對不完全流產(chǎn)大鼠血漿ET含量的影響(±s)

表5 益母草與馬齒莧配伍對不完全流產(chǎn)大鼠血漿ET含量的影響(±s)

注:與空白組比較:*P＜0.05

組別 劑量(g/kg)動物數(shù)(只) ET (pg/mL)空 白 對 照 組 — 10 12.80±3.69模 型 組 — 12 17.04±3.54*宮 血 寧 組 0.0702 12 12.71±4.70益母草與馬齒莧配伍 0.5400 12 13.16±6.77 1.0800 12 15.89±5.52 2.1600 12 15.07±5.38

4 討論

米非司酮配伍米索前列醇建立的早孕大白鼠子宮流產(chǎn)出血模型，可用于功血治療藥的篩選和評價。從實驗結果可以看出，益母草與馬齒莧配伍能明顯緩解米非司酮和米索前列醇導致的早孕大鼠出血癥狀，顯著減少子宮出血量。同時還觀察到，益母草與馬齒莧配伍可減少子宮NO分泌，提高局部TGF-β水平，這可能是通過增加平滑肌和血管的收縮，促使血管內(nèi)膜基底層小動脈收縮而有助于出血的停止。益母草與馬齒莧配伍對外周血流變和內(nèi)膜ET影響不大，提示對血液流變性的改變不是其發(fā)揮作用的主要機制。

［1］王曉東，趙軍寧，張白嘉，等.藥物致早孕大鼠子宮出血模型的建立［J］.中國藥理學通報，1999，15(2):182-184.

［2］尹艷艷，明亮，李前進，等.婦科止血顆粒對早孕大鼠子宮出血的影響［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2003，38(2):120-122.

［3］王樹松，宗文萍，徐鐸，等.柿葉對早孕和中暈大鼠藥物流產(chǎn)子宮出血的影響［J］.河北中醫(yī)藥學院，2004，19(4):1-3.

［4］趙旭曄，段水竹，張永洛.血立停膠囊干預早孕大鼠藥物流產(chǎn)后出血的實驗研究［J］.中國藥物與臨床，2007，7(12):928-930.

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Influence of compatibility of Herba Leonuri and purslane in incomplete abortion uterine hemorrhage of early pregnant rats

DONG Zi-bo1，LI Chao1△，HONG Min2
(1.Jumpcan Medicines Co.，Ltd.，Jiangsu Taixing 225400，China; 2.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu Nanjing，210046，China)

Objective:To observe the effects of Motherwort and purslane compatibility in the treatment of bleeding quantity，hemorheology，locally hormonal level and the expression of estrogen and progesterone receptor on incomplete abortion in early-pregnancy rats.Methods:The experiment was carried out in the early-pregnancy model rats with incomplete abortion uterine bleeding induced by mifepristone and misoprostol.To research the effect and mechanism of the drug in the uterine hemorrhage model rats by observation of the effects of bleeding quantity and hemorheology，the content of ET and NO，the hormone level in blood detected by radioimmunoassay and the changes of estrogen and progesterone receptor by immunohistochemistry.Results:Motherwort and purslane compatibility can reduce secretion of NO of uterine，improve local TGF-β level and reduce uterine bleeding.Conclusion:Motherwort and purslane compatibility can obviously relieve the hemorrhagic symptoms in early-pregnancy rats induced by mifepristone and misoprosto1.

Drug abortion;Radioimmunoassay;Immunohistochemistr;Hemorheology

R285.5

B

1006-3250(2015)01-0056-03

2014-10-04

△

李 超(1980-)，男，醫(yī)學碩士，從事中藥新藥的研發(fā)，Tel:15961037419，E-mail:lc5358583@163.com。