n-3多不飽和脂肪酸對大鼠腦缺血再灌注影響及其機制

武警陜西省總隊醫(yī)院(西安710054)

王 軍 曹 艷 常 江 蔣 敢

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n-3多不飽和脂肪酸對大鼠腦缺血再灌注影響及其機制

武警陜西省總隊醫(yī)院(西安710054)

王 軍曹 艷常 江蔣 敢

目的：觀察n-3多不飽和脂肪酸對腦缺血再灌注損傷的影響并探討其機制。方法：成年雄性SD大鼠54只，隨機分為假手術(shù)組、正常飲食組和高n-3多不飽和脂肪酸飲食組。大鼠喂食6周后，正常飲食組和高n-3多不飽和脂肪酸飲食組的大鼠通過頸內(nèi)動脈線栓法進(jìn)行局灶性缺血再灌注損傷。缺血2h再灌注24h后進(jìn)行神經(jīng)功能損害評分、腦梗死體積測定、腦組織中丙二醛(MDA)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量測定、腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性測定。假手術(shù)組行手術(shù)過程但不行缺血處理。結(jié)果：高n-3多不飽和脂肪酸飲食組大鼠較正常飲食組在缺血再灌注24h后的神經(jīng)功能損害評分明顯降低，腦梗死體積明顯減小，腦組織中MDA和8-OHdG水平顯著下降。SOD、CAT和GSH-Px活性在高n-3多不飽和脂肪酸飲食組大鼠較正常飲食組顯著升高。結(jié)論：高n-3多不飽和脂肪酸飲食可減輕大鼠的腦缺血再灌注損傷?？寡趸瘧?yīng)激能力升高可能參與n-3多不飽和脂肪酸的腦保護作用。

大量統(tǒng)計調(diào)查表明,進(jìn)食魚油等富含n-3多不飽和脂肪酸的飲食可顯著減少腦中風(fēng)的發(fā)生率和病死率。近來的報道也指出,n-3多不飽和脂肪酸對腦缺血損傷有良好的保護作用[1]。盡管有報道指出n-3多不飽和脂肪酸的抗炎效應(yīng)被認(rèn)為是其腦保護作用的機制，但是n-3多不飽和脂肪酸對離體培養(yǎng)的神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等均有顯著地保護作用,這提示n-3多不飽和脂肪酸可直接作用于神經(jīng)組織細(xì)胞起到保護作用[2-3]。氧化應(yīng)激是神經(jīng)細(xì)胞在腦缺血再灌注之后發(fā)生的一個主要病理改變,可明顯導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷[4]。n-3多不飽和脂肪酸不僅可以改變細(xì)胞膜的脂質(zhì)構(gòu)成,而且可通過細(xì)胞內(nèi)代謝來調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能[5]。目前尚不清楚n-3多不飽和脂肪酸是否可以增強腦的抗氧化應(yīng)激能力,從而保護腦功能。本研究在大鼠局灶性腦缺血再灌注模型觀察了n-3多不飽和脂肪酸的腦保護效應(yīng)以及抗氧化應(yīng)激作用。

材料和方法

1 材 料 54只健康成年雄性SD大鼠,由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供。丙二醛(MDA)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性試劑盒也由南京建成生物工程研究所提供。實驗常用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2 動物分組和處理 動物隨機分為假手術(shù)組(S組)、正常飲食組(N組)、高n-3多不飽和脂肪酸組(F組)，每組18只。正常飲食組給予常規(guī)飲食,飲食中n-3多不飽和脂肪酸含量較低(0.4%)。高n-3多不飽和脂肪酸組在正常飲食中加入魚油,增加n-3多不飽和脂肪酸含量達(dá)1.8%。大鼠喂養(yǎng)6周后行腦缺血再灌注損傷。S組大鼠行動脈分離手術(shù)而不進(jìn)行線栓阻斷。腦缺血再灌注大鼠模型制備參照Longa等方法[6]。大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，仰臥固定,頸正中切口分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈,在頸外動脈分叉處結(jié)扎頸總動脈，近心端結(jié)扎頸外動脈,頸內(nèi)與頸外動脈交叉處剪一小口,插入處理后的尼龍線,遇阻力停止,2h后拔出尼龍線,進(jìn)行再灌注。隨后縫合手術(shù)切口,待大鼠麻醉清醒后單籠喂養(yǎng),24 h后進(jìn)行檢測。

3 觀察項目 ①神經(jīng)功能評價：按照Bederson的6級評分標(biāo)準(zhǔn)對再灌注24h之后的大鼠神經(jīng)功能行為進(jìn)行評分。0分,無可見神經(jīng)功能損失；1分,左前爪不能伸直；2分,行走時間斷向左側(cè)傾斜；3分,向左側(cè)持續(xù)轉(zhuǎn)圈；4分，向左側(cè)傾倒；5分,不能行走。②腦梗死體積測定：行為學(xué)評價完畢后,每組取出6只大鼠,麻醉后迅速取腦,冰鹽水冷卻后,1 mm厚度連續(xù)做腦組織冠狀切片,放入2%TTC溶液中于37℃孵育30 min,再用10%甲醛固定,隨后組織切片照相,用圖像分析軟件計算梗死面積,各片的梗死面積之和乘以腦片厚度,得出腦梗死體積。③氧化應(yīng)激檢測：行為學(xué)評價完畢后,各組另12只大鼠麻醉后，迅速取腦，選取腦梗死區(qū)域組織，制備腦組織勻漿，勻漿液經(jīng)低溫離心后取上清用于丙二醛(MDA)、8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平檢測。MDA和8-OHdG檢測采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行，操作步驟按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。腦組織勻漿中的SOD、CAT和GSH-Px的活性檢測采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行。上清中蛋白水平采用BCA蛋白定量方法進(jìn)行。

結(jié) 果

1 神經(jīng)功能學(xué)評價和腦梗死體積 見表1。S組大鼠未見明顯的神經(jīng)功能損害和腦梗死，與之相比，N組和F組大鼠在腦缺血再灌注后均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損害癥狀，評分顯著增高(P<0.01)，腦梗死體積也顯著增大(P<0.01,n=6)。與N組相比，F(xiàn)組的大鼠的神經(jīng)功能評分均顯著下降(P<0.05,n=18)，腦梗死體積也顯著減少(P<0.05,n=6)。

表1 高n-3多不飽和脂肪酸飲食對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

注：與S組比較，*P<0.01；與N組比較，△P<0.05

2 氧化應(yīng)激檢測 見表2。與S組相比，N組和F組大鼠的腦組織中MDA和8-OHdG水平均顯著升高(P<0.01,n=12)。與N組相比，F(xiàn)組大鼠腦組織中MDA和8-OHdG水平降低，具有顯著性差異(P<0.05,n=12)。與S組相比，N組中SOD、CAT、GSH-Px的活性顯著下降(P<0.01，n=12)。F組大鼠的腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性較N組顯著提高(P<0.05，n=12)。

表2 高n-3多不飽和脂肪酸飲食對缺血再灌注損傷大鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響

注：與S組比較，*P<0.01；與N組比較，△P<0.05

討 論

本研究明確了n-3多不飽和脂肪酸對腦缺血再灌注的改善作用，并指出n-3多不飽和脂肪酸發(fā)揮保護作用與抗氧化應(yīng)激有關(guān)。在以往許多腦缺血損傷的動物模型中，n-3多不飽和脂肪酸被證實對腦缺血損傷具有一定的保護作用[7]。本研究通過飲食給予n-3多不飽和脂肪酸6周而達(dá)到了顯著的減輕腦缺血再灌注損傷的效果，這進(jìn)一步說明n-3多不飽和脂肪酸具有腦保護作用。同時，這也提示口服n-3多不飽和脂肪酸或可成為一個安全、有效、方便、經(jīng)濟的減輕腦缺血再灌注損傷的方法。

n-3多不飽和脂肪酸具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，它可改變細(xì)胞膜磷脂的構(gòu)成，間接改變細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)信號途徑和膜的反應(yīng)性。n-3多不飽和脂肪酸可抑制血小板TXA2形成，抑制血小板聚集和血栓形成。n-3多不飽和脂肪酸還可通過競爭環(huán)氧酶而減少炎性介質(zhì)的生成，起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[8]。本研究則明確了n-3多不飽和脂肪酸在大鼠缺血再灌注腦組織具有抗氧化應(yīng)激作用。MDA和8-OHdG分別是脂質(zhì)過氧化和 DNA氧化損傷的標(biāo)記物，其水平可反映機體氧化應(yīng)激程度[9]。MDA和8-OHdG升高表明缺血再灌注誘導(dǎo)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生。高n-3多不飽和脂肪酸飲食則減輕了缺血再灌注誘導(dǎo)的MDA和8-OHdG升高，說明n-3多不飽和脂肪酸具有一定的抗氧化應(yīng)激的能力。

氧化應(yīng)激是機體在各種有害刺激作用下,體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基生成過多，超出機體抗氧化能力，導(dǎo)致組織的氧化損傷。程暢河等[10]報道：厚樸酚能通過抗氧化作用,顯著縮小腦缺血再灌注后的梗死范圍,降低腦水腫的程度,減少腦組織氧自由基的生成以及Caspase-3的活性。正常機體存在抗氧化系統(tǒng)，包括SOD、CAT、GSH-Px等酶。這些酶可清除氧自由基，防止氧化損傷[11]。本研究發(fā)現(xiàn),缺血再灌注24h后組織中SOD、CAT、GSH-Px活性顯著下降，這可能是大量氧自由基造成的酶活性抑制。高n-3多不飽和脂肪酸飲食組的大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性較正常飲食組明顯升高，這可提高腦組織抗氧化能力，減少氧化損傷和腦組織損害。增強抗氧化能力可能是n-3多不飽和脂肪酸保護腦組織的一個重要原因。n-3多不飽和脂肪酸抗炎和抗血栓形成的作用均可顯著改善缺血再灌注腦組織的氧化應(yīng)激程度，從而保護腦組織。另一方面，n-3多不飽和脂肪酸可能直接調(diào)控神經(jīng)組織細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px的表達(dá)和活性，產(chǎn)生抗氧化作用。其具體的作用機制尚有待進(jìn)一步明確。

腦缺血再灌注損傷一直是臨床面臨的一個難題，確定有效的防護措施十分必要。目前，有多種藥物被報道可起到減輕腦缺血再灌注損傷的效果。本研究表明，n-3多不飽和脂肪酸減輕腦缺血再灌注損傷，這為臨床上防治腦缺血再灌注損傷提供了一種可能的非藥物性治療舉措。

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(收稿：2015-01-15)

腦 再灌注損傷 氧化性應(yīng)激 脂肪酸類,ω-3

R743.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.006