雙波長分光光度法測定新鮮懷山藥中直鏈與支鏈淀粉的含量

王麗霞,李 彬,楊事維,曹金麗,劉相花,張 凱

(食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室,天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457)

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雙波長分光光度法測定新鮮懷山藥中直鏈與支鏈淀粉的含量

王麗霞,李 彬,楊事維,曹金麗,劉相花,張 凱

(食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室,天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457)

以新鮮懷山藥為原料制備山藥粉,通過石灰水浸泡工藝提取山藥淀粉。以碘為顯色劑,掃描直鏈淀粉和支鏈淀粉與碘形成復合物的全波長吸收光譜。利用不同濃度的直鏈與支鏈淀粉標準品分別與碘形成復合物從而得到淀粉含量與吸光度差值之間的線性關系制作出標準曲線,根據(jù)標準曲線計算出樣品中直鏈淀粉與支鏈淀粉的含量。根據(jù)雙波長選擇原理和掃描光圖譜,確定直鏈淀粉的測定波長為560nm,參比波長為659nm;支鏈淀粉的測定波長為600nm,參比波長532nm。實驗說明直鏈淀粉與支鏈淀粉的測定相對標準偏差分別為0.27%與0.63%、回收率也分別達到了96.18%與97.89%,檢出限分別為0.09mg/L與1.58mg/L,再經(jīng)準確性分析驗證了用雙波長法測定山藥淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉的含量的檢測方法具有較為準確的效果。

山藥,雙波長,直鏈/支鏈淀粉

山藥為薯蕷科植物薯蕷(DioscoreaoppositaThunb.)的塊莖,具有補脾養(yǎng)胃、補肺益腎的功效,對于預防治療脾虛久泄、慢性腸胃、肺虛咳喘、糖尿病等疾病有重要作用[1]。山藥塊莖中含多糖、淀粉、蛋白質、游離氨基酸等[2]。山藥中含大量淀粉,是重要的淀粉來源,然而當前對于植物淀粉的研究大都數(shù)都集中于馬鈴薯和玉米淀粉上,對于山藥淀粉卻研究較少。這些都影響了山藥淀粉的應用及其深加工的發(fā)展[3-5]。

淀粉是植物世界中儲備碳水化合物的物質,人類可以利用其中70%～80%的熱量,淀粉通常以1～100μm或者更大直徑的顆粒狀形式存在。淀粉是由脫水葡萄糖通過α-D-(1-4)糖苷鍵連接而形成的高分子碳水化合物。雖然淀粉的精細結構還沒有得到闡述,但是已經(jīng)確定了淀粉是由支鏈淀粉與直鏈淀粉兩種異構物質按照不同比例構成的。直鏈淀粉基本上是由脫水葡萄糖通過α-D-(1-4)糖苷鍵組成的線性聚合物而支鏈淀粉卻是由α-D-(1-4)糖苷鍵連接的分支狀聚合物,在O-6的位置上有周期性的分支[6]。

山藥淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量因山藥品種不同以及種植地區(qū)的不同而有所差異,決定著山藥淀粉的品質,并影響著山藥淀粉的加工特性與應用。所以測量山藥淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉的含量有著重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮懷山藥 產(chǎn)自河南溫縣。

直鏈、支鏈淀粉標準品 購于Sigma公司;石油醚、無水乙醇、氫氧化鈣、氫氧化鉀、鹽酸、碘、碘化鉀、正丁醇等均為分析純。

DF-101S恒溫水浴鍋 山東甄誠嘉德儀器廠;ESJ205-4電子分析天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司;UV-2550PC紫外-可見分光光度計 日本島津(中國)儀器公司;DFG801電熱鼓風箱 湖北省黃石市醫(yī)療器械廠;G10S紫外可見分光光度計 美國賽默飛公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山藥淀粉的提取山藥粉的制備工藝:山藥→清洗→去皮→切片→烘干→粉碎→過篩→山藥粉。將得到的山藥粉用pH8的Ca(OH)2按照固液比1∶7浸泡,浸泡時間2h并重復4次;將沉淀用90%乙醇浸泡2h后烘干;利用索氏抽提對所得到的山藥淀粉進行脫脂處理[7]。

1.2.2 直鏈淀粉與支鏈淀粉的分離純化 采用正丁醇反復結晶法,稱取10g淀粉,加入到500mL的燒杯中,加入少量無水乙醇和蒸餾水使樣品濕潤,再加入0.5mol/L的NaOH 350mL,沸水浴中加熱攪拌20～30min至完全分散,冷卻后離心(4000r/min,20min)去沉淀,再以2mol/L的HCl調節(jié)pH至中性,加入100mL正丁醇-異戊醇(3∶1體積比)混合液,然后在沸水浴中加熱攪拌至溶液透明后冷卻至室溫,于4℃冰箱中靜置24h后離心(4000r/min,20min),離心后得到的上清液即為粗支鏈淀粉溶液(Ap),得到的沉淀為粗直鏈淀粉(Am)。

支鏈淀粉的純化:上清液中加入20mL正丁醇于沸水浴中加熱攪拌至溶液分散透明后冷卻至室溫。在4℃冰箱中靜置24h后離心(4000r/min,20min)棄去沉淀并重復以上操作5次。將收集到的上清液按照2倍體積加入無水乙醇進行沉淀,再以無水乙醇洗滌沉淀5、6次,所得到的沉淀在45℃的烘箱中干燥即為支鏈淀粉(Ap)樣品。

直鏈淀粉的純化:向粗直鏈淀粉中加入240mL的正丁醇-水(體積比為1∶8)溶液,在沸水浴中加熱攪拌使其溶解至透明,冷卻后于4℃冰箱中靜置24h,取出后離心(4000r/min,20min)得到的沉淀,重復以上操作5次后將收集到的沉淀用無水乙醇洗滌5～6次,將樣品于45℃烘箱中干燥即得到直鏈淀粉(Am)樣品。

1.2.3 淀粉標準液的配制 分別稱取0.1000g支鏈淀粉和直鏈淀粉置于100mL的燒杯中,加入1mol/L的KOH溶液10mL,于80℃水浴中充分攪拌15min,再用蒸餾水定容至50mL為支鏈淀粉和直鏈淀粉標準液。采用1mol/L的KOH溶液在80℃水浴下分散溶解15min效果最好[8]。

1.2.4 直鏈淀粉標準曲線的繪制 分別取直鏈淀粉標準液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于100mL燒杯中,加蒸餾水25mL,以0.1mol/L的HCl溶液調pH至3.0,加0.5mL碘試劑后定容至50mL,靜置30min。

1.2.5 支鏈淀粉標準曲線的繪制 分別取支鏈淀粉標準液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于100mL燒杯中,加蒸餾水25mL,以0.1mol/L的HCl溶液調pH3.0,加0.5mL碘試劑后定容至50mL,靜置30min。

1.2.6 直鏈淀粉、支鏈淀粉含量的測定 稱取0.1000g的脫脂淀粉,加1mol/L的KOH溶液10mL于100mL燒杯中,將燒杯置于80℃水浴中充分攪拌10min,然后用蒸餾水定容到50mL的容量瓶中,搖勻后靜置。取3mL上清液于100mL燒杯中,以加蒸餾水25mL,以0.1mol/L的HCl溶液調節(jié)pH至3.0,加0.5mL的碘試劑后轉移溶液到50mL的容量瓶中,用蒸餾水加至刻度搖勻后靜置。

1.3 山藥淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉含量的雙波長標準曲線

以蒸餾水為空白,將1.2.4中的支鏈淀粉標準溶液,用紫外-可見分光光度計分別在波長λ1和參比波長λ3下相應的吸光值A1和A3。以ΔA支=λ1-λ3為縱坐標,支鏈淀粉質量濃度ρ1(mg/L)為橫坐標作圖,利用excel繪制雙波長支鏈淀粉標準曲線。采用同樣方法,將1.2.5中的直鏈淀粉標準溶液,用紫外-可見分光光度計分別在波長λ2和參比波長λ4下測定吸光度A2和A4,以ΔA直=A2-A4為縱坐標,直鏈淀粉質量濃度ρ2(mg/L)為橫坐標作圖,繪制雙波長直鏈淀粉標準曲線。

1.4 重復性實驗

對同一樣品進行重復測定,驗證該實驗方法的穩(wěn)定性以及可行性。

1.5 準確性與準確度評價方法

在已測得直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的樣品中,添加準確稱量的自制直鏈和支鏈淀粉純品,按照上述方法測定直鏈和支鏈淀粉的含量,通過以下公式計算回收率和平均回收率。

回收率(%)=混合后測得量-樣品中直鏈淀粉或支鏈淀粉含量/淀粉純品的加入量×100

準確度主要是通過回收率來反映,分別稱取標準品直鏈淀粉與支鏈淀粉5份,記錄數(shù)據(jù)后按照上述方法分別測定其含量,將實測值與理論值比較,計算回收率。并計算出平均回收率以及相對標準偏差(RSD)。

1.6 檢出限實驗

式(1)

式(2)

根據(jù)下式求得檢出限:

DL=k·s1

式(3)

式中:DL-檢出限,mg/L或%;s1-濃度或含量測定結果的標準差,mg/L或%;k-2或3。

2 結果與分析

根據(jù)雙波長比色原理[11],若試樣溶液在兩個波長處均有吸收,則兩個波長處的吸光值差值與溶液中待測物質的濃度存在線性關系,從樣品溶液中的直鏈、支鏈淀粉分別與碘生成絡合物的吸收光譜中,可以確定測定波長和參比波長。

2.1 直鏈、支鏈淀粉測定波長的確定

直鏈淀粉與碘作用產(chǎn)生純藍色,支鏈淀粉與碘作用生成紫紅色。用這兩種淀粉的標準溶液分別碘反應,用紫外可見分光光度計對其分別進行全波長掃描,掃描結果見圖1。選擇波長需要具備兩個基本條件,一是同存組分在這兩個波長應具有相同的吸收值,使其濃度變化不影響到測定值,二是待定組分在這兩個波長的差值應足夠大[12]。因此,根據(jù)上述原理和掃描的圖譜,確定直鏈淀粉的測定波長λ2=560nm,參比波長λ4=659nm。支鏈淀粉的測定波長λ1=600nm,參比波長λ3=532nm。

圖1 淀粉全波長圖Fig.1 Full wavelength figure of starch

2.2 雙波長標準曲線繪制結果

2.2.1 直鏈淀粉標準曲線 使用紫外可見分光光度計在測定波長560nm、參比波長659nm下分別測定吸光值,以直鏈淀粉濃度為橫坐標,以吸光值的差值為縱坐標繪制標準曲線,得到標準曲線的方程:y=0.0069x+0.0042,R2=0.9990。

圖2 直鏈淀粉標準曲線Fig.2 Standard curve of amylose

2.2.2 支鏈淀粉標準曲線 使用紫外可見分光光度計在測定波長600nm、參比波長532nm下分別測定吸光值,以支鏈淀粉濃度為橫坐標,以吸光值的差值為縱坐標繪制標準曲線,得到標準曲線的方程:y=0.0010x+0.0068,R2=0.9989。

圖3 支鏈淀粉標準曲線Fig.3 Standard curve of amylopectin

2.3 重復性實驗

對同一樣品進行重復四次測定,結果如表1所示。

表1 重復性實驗結果Table 1 Repetitive experimental result

由表1可以看出,通過四次實驗測得懷山藥中直鏈、支鏈淀粉含量,相加后求百分比可以得出懷山藥中直鏈淀粉約占23.96%,支鏈淀粉約占76.04%,且相對標準偏差不超過1%,實驗方法重復性良好。

2.4 雙波長測定方法的準確性與準確度實驗結果分析

取已測知直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的山藥淀粉,分別在其中添加一定量的直鏈淀粉或支鏈淀粉的純品,按照1.2.6所述的實驗方法,計算回收率,結果見表2。

表2 樣品回收率測定結果Table 2 Recovery rate determination result of sample

表3 準確度分析Table 3 Accuracy analysis

由表2可知:無論是直鏈淀粉還是支鏈淀粉,其平均回收率均在96%～98%之間,同時在表3中可以看出,平均回收率在98%到102%之間,且回收率的相對標準偏差也小于2%,在可接受范圍內(nèi)。說明該分析方法具有較高的準確度,適用于測定山藥中的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。

2.5 檢驗限實驗分析

分別直鏈淀粉和支鏈淀粉的樣品重復測定12次,結果如下:

表4 檢驗限測定結果Table 4 Result of detection limit

根據(jù)1.6中的式(3)分別計算出直鏈淀粉的DL=0.09mg/L,支鏈淀粉的DL=1.58mg/L。證明該方法實用性很強，可檢測范圍較大。

3 結論

雙波長分光光度法作為淀粉含量的快速測定方法,具有準確性高、重復性和穩(wěn)定性好的特點,可以應用于不同品種的山藥以及其他類型的淀粉的測定,根據(jù)吸收光譜特性分析結果,新鮮山藥直鏈淀粉的測定波長為560nm,參比波長為659nm。支鏈淀粉

的測定波長為600nm,參比波長為532nm。實驗表明,顯色反映在pH3～5范圍內(nèi)影響不大。

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Determination of amylose and amylopectin content infresh yam by dual-wavelength spectrophotometry

WANG Li-xia,LI Bin,YANG Shi-wei,CAO Jin-li,LIU Xiang-hua,ZHANG Kai

(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education;Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China)

Yam starch was extracted through soak process by whitewash with yam powder which was from fresh yam as raw material. A standard curve was got based on the line relationship between absorption difference and content of starch,which the concentration cycle of standard amylose and amylopectin were used. This research had finally got 560nm for measure wavelength while 659nm for reference wavelength of amylase,600nm for measure wavelength while 532nm for reference wavelength of amylopectin according to the amylose and amylopectin complex full wavelength absorption spectra with iodine as chromogenic agent. The research about content of amylose and amylopectin in the sample with the standard curve had been worked out. According to the experiment,the RSD were 0.27% and 0.63% respectively,recovery data were 96.18% and 97.89%,while detection limit were 0.09mg/L and 1.58mg/L based on the amylose and amylopectin test. Appending accuracy analysis,allconfirmed that the dual-wavelength determining the content of amylose and amylopectin had more accurate effect.

yam;dual-wavelength;amylose/amylopectin

2014-03-24

王麗霞(1966-)，女，碩士，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與功能食品。

河北省省級省?？萍己献鏖_發(fā)項目。

TS255.1

A

1002-0306(2015)05-0292-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.053