黑茶中茶多酚的醇水-超臨界CO2流體聯(lián)合提取

尹志芳,彭曉赟,楊宇強,謝 文,趙運林

(湖南城市學院化學與環(huán)境工程學院,湖南益陽 413000)

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黑茶中茶多酚的醇水-超臨界CO2流體聯(lián)合提取

尹志芳,彭曉赟,楊宇強,謝 文,趙運林*

(湖南城市學院化學與環(huán)境工程學院,湖南益陽 413000)

以自制黑茶為研究對象,分別采用超臨界CO2萃取法、醇水浸提法及醇水浸提-超臨界CO2聯(lián)合萃取法對茶樣中的茶多酚進行提取,用正交實驗法優(yōu)化了提取條件,以沒食子酸為標準品,在765nm處用紫外可見分光光度法檢測產(chǎn)品中茶多酚的含量,計算了茶多酚的得率及萃取樣中產(chǎn)品的純度,并對三種產(chǎn)品的DPPH·清除率進行了比較。結(jié)果表明:3種方法中醇水-超臨界CO2聯(lián)合萃取法的得率和純度最高。聯(lián)合浸提最優(yōu)條件為:先用乙醇濃度80%,料液比1∶10g/mL,60℃下浸提2.0h,然后25MPa,50℃下超臨界CO2萃取時間2h。茶多酚的得率為6.36%±0.81%,產(chǎn)品純度為:41.22%±3.19%。產(chǎn)品對DPPH·的清除率為90.64%±0.0187%。該方法綠色環(huán)保,未添加任何有害溶劑,為黑茶飲品的進一步研究開發(fā)提供參考。

黑茶,茶多酚,超臨界CO2,聯(lián)合提取

茶多酚是茶葉中多羥基酚類化合物的總稱,由兒茶素類、黃酮甙類、花青甙類、酚酸類、縮酚酸類等30多種化學物質(zhì)組成,也是一種天然的無毒抗氧化劑。對食品、化妝品、保健品具有優(yōu)異的抗氧化能力和防腐保鮮作用的功能已被大家所熟知,許多發(fā)達國家把這種天然的抗氧劑作為化學抗氧劑的最佳替代品,已廣泛用作各類食品添加劑[1]。

目前茶多酚常見的提取方法有:水浸提法[2]、常壓溶劑提取法[3-5]、離子沉淀法[6]、真空耦合超聲提取法[7]、超高壓提取法[8]、超臨界CO2流體萃取法[9-10]等。上述方法大都單獨考察萃取茶多酚的工藝條件,而采用醇水-超臨界CO2流體聯(lián)合萃取技術(shù)獲取茶葉中的茶多酚的研究則較少有報道。由于超臨界CO2萃取茶多酚存在產(chǎn)品較純,綠色環(huán)保,但得率不高的現(xiàn)象,而溶劑提取法存在提取方法簡單,得率較好,但雜質(zhì)較多等問題,故本文分別比較了超臨界CO2流體萃取法,醇水浸提法,醇水-超臨界CO2流體聯(lián)合萃取法提取茶多酚的得率和純度差異,并初步考察了最優(yōu)條件下三種提取物的抗DPPH·的效果,以期找到最優(yōu)的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑茶 湖南城市學院黑茶研究所自制散茶;福林酚試劑 上海荔達生物科技有限公司;沒食子酸標準品 純度>98%,上海江萊生物科技有限公司;無水乙醇、甲醇、無水碳酸鈉 均為分析純；水為二次蒸餾水。

HA121-50-02型超臨界萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司;RE2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司;U-3010紫外分光光度計 日本島津公司;SF-130型粉碎機 湖南中誠制藥機械廠;FD-1PF真空冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;PC-104型萬分之一分析天平 上海精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的預處理 茶葉樣品根據(jù)GB/T 8303-2003[11]中的茶葉磨碎方法,先用粉碎機將茶葉粉碎并過60目篩,然后按GB/T 8304-2003[12]中的120℃烘干法對茶樣進行烘干。

1.2.2 茶樣的提取方法 方法1:超臨界CO2流體萃取法(SFC)。取100g茶粉置于萃取釜,以不同濃度的乙醇作為夾帶劑,進行超臨界CO2流體萃取,2h后收集分離釜中的提取液。影響茶多酚提取效果的因素很多,根據(jù)相關(guān)文獻[9-10]提及的單因素實驗及預實驗確定因素范圍。采用正交實驗法優(yōu)化超臨界CO2的萃取條件,正交實驗方案設(shè)計如表1所示。

表1 超臨界CO2流體萃取正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels for SFC extraction method

方法2:醇水浸提法。取1g茶粉,在溶劑中先超聲30min,根據(jù)相關(guān)文獻[3-5]提及的單因素實驗及預實驗確定因素范圍。采用正交實驗法優(yōu)化溶劑浸提條件,見表2,然后合并浸提液。

方法3:醇水浸提-超臨界CO2流體聯(lián)合萃取法。由于CO2為非極性物質(zhì),茶多酚在超臨界CO2流體中的溶解度較低,直接浸提的茶多酚得率較低,故取方法2中的最優(yōu)溶劑浸提條件先進行溶劑法提取茶葉中的茶多酚,在不加夾帶劑情況下進行超臨界CO2流體提取,將茶湯中的茶多酚進行提純,并盡量減少茶多酚的損失。實驗條件如表3所示。

表2 醇水浸提正交實驗因素水平表Table 2 Factors and levels for solvent extraction method

表3 聯(lián)合浸提正交實驗因素水平表Table 3 Factors and levels for solvent-SFC co-extraction method

1.2.3 茶多酚的得率及產(chǎn)品純度測定及計算方法 各提取液經(jīng)0.45μm濾膜過濾→濾液旋蒸去溶劑→用水溶解定容→產(chǎn)品真空冷凍干燥→產(chǎn)品干粉→取部分干粉→用水溶解定容→乙酸乙酯萃取→酯相經(jīng)檸檬酸水溶液洗滌→減壓濃縮回收乙酸乙酯→用水溶解定容,以沒食子酸為標準品,用紫外分光光度法測產(chǎn)品中茶多酚(GB/T 8313-2008[13])的總含量。計算茶多酚的得率(%)=茶多酚質(zhì)量/茶樣質(zhì)量×100。產(chǎn)品干粉中茶多酚純度計算方法:純度(%)=茶多酚質(zhì)量/產(chǎn)品干粉質(zhì)量×100。

1.2.4 茶葉浸提物對DPPH·的清除作用 將三種提取方法得到的產(chǎn)品干粉取部分樣品用無水乙醇溶解稀釋至400μg/mL作為樣品溶液,取樣品溶液100μL于96孔板上,加入濃度0.2μmol/L的DPPH 100μL作為樣品組,以無水乙醇代替溶液作為參比溶液,以無水乙醇代替DPPH溶液作為背景組,以無水乙醇代替樣品溶液作陰性對照,以濃度為400μg/mL的維C溶液代替樣品溶液作陽性對照組,置30℃培養(yǎng)箱30min,用酶標儀測定每孔517nm吸光值,重復3次實驗。以維生素C溶液為陽性對照。提取物對DPPH·的抑制率計算[14]:

清除率(%)=[1-(OD樣品/陽性-OD背景)/OD陰性]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸的標準曲線

采用波長掃描確定沒食子酸標準品的最大吸收波峰位置(765nm),在最大吸收波長處進行吸光度的測定,得到的標準曲線如圖1所示。

圖1 沒食子酸的標準曲線Fig.1 The standard curve of Gallic acid

沒食子酸標準曲線方程為:Y=0.0375+0.0097C,R2=0.9990,說明沒食子酸吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 茶多酚的譜圖分析

圖2分別為黑茶樣品經(jīng)聯(lián)合浸提后的萃取產(chǎn)品經(jīng)乙酸乙酯純化后茶多酚(a)及沒食子酸標準品(b)的紫外圖譜。由圖可知,樣品中的吸收峰位置和標準品基本一致,未出現(xiàn)雜質(zhì)峰,說明測試樣品具有較好的純度。

圖2 茶樣及沒食子酸標準品的紫外圖譜 Fig.2 The UV spectrums of standard and tea sample

2.3 超臨界CO2流體萃取結(jié)果分析

由正交實驗結(jié)果可知,各因素對萃取率的影響的顯著性大小為:溫度A>壓力B>夾帶劑用量D>濃度C。最佳萃取條件為:A2B3C1D2,即萃取溫度50℃、萃取壓力25MPa、夾帶劑濃度60%、夾帶劑用量1∶20(g∶mL)。重復3次最佳實驗條件,茶多酚得率為0.76%±0.03%,產(chǎn)品純度為:32.59% ±1.72%。和文獻[9]相比,該得率偏低,分析原因是:文獻[9]的超臨界萃取對象是綠茶,本論文體系是黑茶,黑茶經(jīng)過發(fā)酵后茶多酚被部分氧化,含量降低;超臨界萃取效果受儀器設(shè)備的限制,文獻采用了美國Foss公司設(shè)備,儀器承受壓力和精密性均強于本文中的設(shè)備。

2.4 醇水浸提結(jié)果分析

由表5可知,各因素對茶多酚提取率影響大小依次為:乙醇濃度C>浸提時間B>料液比D>浸提溫度A。茶多酚提取率最佳的工藝條件為:A2B3C3D1,即浸提溫度60℃,浸提時間2.0h,乙醇濃度80%,料液比1∶10g/mL,重復3次最佳實驗條件,茶多酚得率為6.25%±0.46%,產(chǎn)品純度為:21.37%±1.51%。

2.5 醇水-超臨界CO2聯(lián)合浸提結(jié)果分析

經(jīng)2.4中最優(yōu)條件下提取的茶湯再進行超臨界CO2聯(lián)合浸提。由表6可知,各因素對茶多酚的得率影響不大,對產(chǎn)品純度的影響較為顯著,顯著性大小為:溫度A>壓力B>萃取時間C。最佳萃取條件為:A2B3C2,即萃取溫度50℃、萃取壓力25MPa、萃取時間2h。重復3次最佳實驗條件,茶多酚得率為6.36%±0.81%,產(chǎn)品純度為:41.22% ±3.19%。茶樣醇水提取物經(jīng)聯(lián)合浸提后茶多酚的純度由21.37%提高到了41.22%,說明超臨界CO2流體萃取了部分咖啡堿、小分子色素、部分酯類、蛋白等物質(zhì)。同時,茶多酚的得率變化不大,說明未加攜帶劑時,茶多酚在超臨界CO2流體中的溶解度很小,茶多酚的損失很少。

表4 超臨界CO2流體萃取結(jié)果分析Table 4 Results of SFC extraction method

表5 醇水浸提結(jié)果分析Table 5 Results of solvent extraction method

2.6 茶葉浸提物對DPPH·的清除作用

比較三種不同方法的茶樣提取物對DPPH·的清除效果如表7所示,由表7可知:茶葉經(jīng)聯(lián)合浸提方法得到的產(chǎn)品干粉對DPPH·具有很好的清除效果。

3 結(jié)論

經(jīng)紫外可見分光光度法獲得的沒食子酸吸光度和濃度有良好的線性關(guān)系。

經(jīng)SFC法得到的茶多酚產(chǎn)品純度較好,但得率較低。醇水浸提法得到的產(chǎn)品得率較好,產(chǎn)品純度偏低,醇水-SFC聯(lián)合浸提法在最佳提取條件下得到的茶多酚產(chǎn)品純度較醇水浸提后由21.37%明顯提高至41.22%,得率變化不大,說明茶多酚在提純過程中無損失。相同濃度下,茶湯的香味基本無變化,無苦澀味,顏色稍有變淺。茶湯中的其他成分如咖啡堿、茶褐素、茶黃素等量的變化有待于進一步研究。

表6 醇水-超臨界CO2聯(lián)合浸提結(jié)果分析Table 6 Results of solvent-SFC co-extraction method

表7 茶葉提取物對DPPH·的清除效果(n=3)Table 7 The clearing effect of tea extract on the DPPH·(n=3)

醇水-SFC聯(lián)合浸提的產(chǎn)品呈現(xiàn)較好的去DPPH·效果。該提取物可能進一步開發(fā)成黑茶飲品,為黑茶的進一步研究和開發(fā)提供一種可能的發(fā)展途徑。

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Solvent-SCF co-extraction oftea polyphenols from black tea

YIN Zhi-fang,PENG Xiao-yun,YANG Yu-qiang,XIE Wen,ZHAO Yun-lin*

(Department of Chemistry & Environmental Engineering,Hunan City University,Yiyang 413000,China)

Homemade black tea as research object,Supercritical CO2fluid extraction(SCF),Solvent leaching and SCF-Solvent co-extraction were used to extract tea polyphenols from black tea with orthogonal tests to optimize the extraction technology,then the yields and purities of tea polyphenols in the samples which were calculated after ultraviolet detection at 765nm with gallic acid as standard sample. And the DPPH· clearance rates were studied between the extraction methods. The results showed that the Solvent-SCF co-extraction was the best method. After Solvent leaching(ethanol concentration 80%,solid to liquid 1∶10g/mL,extraction temperature 60℃,extraction time 2h),the solution were extracted with SCF at 25MPa,50℃ for 2h.Under the best conditions for the Solvent-SCF co-extraction method,high yield and high purity of tea polyphenols can be obtained with yield of 6.36% ± 0.81% and purity of 41.22% ± 3.19%.The DPPH· clearance rate of products was 90.64% ± 0.0187%. This method was environmental protection,not adding any harmful solvents,which can provide the reference for the further development of black tea research.

black tea;tea polyphenols;Supercritical CO2;co-extraction

2014-07-24

尹志芳(1978-)，女，碩士，副教授，主要從事新型分離技術(shù)研究。

*通訊作者:趙運林(1959-)，男，博士，教授，主要從事生態(tài)植物學研究。

黑茶發(fā)酵及功能成分提取技術(shù)湖南省應用基礎(chǔ)研究基地開放課題(2013HCKF02);湖南省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育項目(11CY004);湖南省普通高校校企合作人才培養(yǎng)示范基地開放基金項目(湘教通〔2012〕434號); 國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201211527007)。

TS205

B

1002-0306(2015)05-0194-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.032