采用不同蛋白酶制備羊胎盤抗氧化肽的研究

周潔靜,侯銀臣,劉旺旺,肖 琳,楊公明

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

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采用不同蛋白酶制備羊胎盤抗氧化肽的研究

周潔靜,侯銀臣,劉旺旺,肖 琳,楊公明*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

選取羊胎盤為實(shí)驗(yàn)材料,以水解度、多肽含量和DPPH自由基清除率為考察指標(biāo),采用生物酶法對(duì)羊胎盤酶解制備抗氧化肽進(jìn)行了研究。采用8種蛋白酶,在最優(yōu)的酶解條件下對(duì)羊胎盤進(jìn)行酶解制備抗氧化活性肽。結(jié)果表明,風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH清除的IC50分別為0.6420、0.7120和0.6781mg/mL。說(shuō)明該三種酶對(duì)羊胎盤酶解制備抗氧化肽的效果比較好。

生物酶法,羊胎盤,抗氧化肽,水解度,DPPH自由基的清除率

大量研究證明,肽和蛋白類成分是一種良好的抗氧化劑[1]。特別是介于一定分子量范圍的小肽具有超強(qiáng)抗氧化、防衰老活性[2],其能夠有效清除體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的自由基,對(duì)維護(hù)人體的健康平衡具有重要的意義。這些具有抗氧化活性的小肽可以通過(guò)酶解大分子蛋白質(zhì)得到,如酶解魚(yú)皮膠原、酶解大豆粉、酶解牡蠣等[3-5]。然而各種蛋白酶都具有相對(duì)的底物專一性,不同蛋白酶其作用位點(diǎn)也不一樣。酶解產(chǎn)物的生物活性與分子量的大小和酶切位點(diǎn)的選擇有著密不可分的聯(lián)系,而分子量的大小和酶切位點(diǎn)的選擇可以通過(guò)酶解時(shí)間的控制和選擇不同的蛋白酶達(dá)到目標(biāo),因此有必要重點(diǎn)研究酶解時(shí)間和酶制劑的選擇對(duì)酶解產(chǎn)物生物活性的影響[6]。

我國(guó)羊資源豐富,目前羊存欄數(shù)近四億只,羊肉產(chǎn)量超過(guò)500萬(wàn)t,每年可以開(kāi)發(fā)利用的羊胎盤潛藏量高達(dá)450萬(wàn)個(gè)。羊的生殖期較集中,在一個(gè)月甚至幾周。所以,胎盤收集容易,加之速凍技術(shù)的應(yīng)用,質(zhì)量能夠保證。目前,羊胎盤加工量不到3%,造成巨大的資源浪費(fèi),又污染環(huán)境。近年來(lái),對(duì)羊胎盤酶解制備活性肽的國(guó)內(nèi)外研究不多,Togashi S[7]研究發(fā)現(xiàn)羊胎素能降低大鼠血清中丙二醛(MDA)含量,表明羊胎素能使大鼠血清脂質(zhì)過(guò)氧化程度降低,并能提高大鼠血清SOD活性,提高機(jī)體免疫能力。王善輝[8]等以山羊胎盤酶解制備的活性肽為原料,喂食幼犬,結(jié)果表明羊胎盤活性肽可提高幼犬的免疫功能和抗氧化能力,從而提高幼犬的抗病防病能力。本文以羊胎盤作為原料,采用生物酶解技術(shù)對(duì)羊胎盤酶解制備抗氧化肽進(jìn)行研究,研究酶解過(guò)程中水解度、多肽含量與DPPH·清除率的關(guān)系,以期為羊胎盤的深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊胎盤 山羊分娩的羊胎盤;木瓜蛋白酶(3.29×103U/g) 購(gòu)自南寧龐博生物工程有限公司;復(fù)合蛋白酶(4.30×103U/g),風(fēng)味蛋白酶(3.97×103U/g),堿性蛋白酶(3.04×103U/g),中性蛋白酶(4.69×103U/L),水解蛋白酶(3.43×103U/L) 購(gòu)自諾維信中國(guó)銷售代理廣州明曜公司;胰蛋白酶(3.07×103U/g) 購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;菠蘿蛋白酶(3.00×103U/g) 購(gòu)自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司;DPPH·(二苯代苦味肼基自由基) 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;其余試劑均為分析純。

雷磁PHS-3DpH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;KDN-04A凱氏定氮儀 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司;日立氨基酸分析儀L-8800 日本日立有限公司;85-2A恒溫磁力攪拌器 常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠;SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器 常州普天儀器制造有限公司;UV5100型分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊胎盤抗氧化肽的制備 羊胎盤→液氮打漿→提取水溶性蛋白→離心,收集沉淀→酶解→滅酶→離心→酶解液

對(duì)分娩的羊胎盤立即收集并速凍保藏,羊胎盤流水解凍之后經(jīng)液氮打漿。用pH7.5的磷酸緩沖液在料液比1∶5,溫度20℃的條件下攪拌提取2h,在4000r/min,4℃條件下離心20min,收集沉淀并測(cè)定水份含量作為酶解原料。

稱取一定質(zhì)量的羊胎盤酶解原料于三角瓶中,按固液比1∶50(g蛋白/mL)加入蛋白酶作用最適pH的磷酸鹽緩沖溶液,攪拌使羊胎盤充分混勻,按酶與底物的比值([E]/[S])為1∶4000添加蛋白酶,在蛋白酶最適條件(表1)下酶解,每隔1h取樣并迅速置于沸水中滅酶10min,冷卻至室溫后,4000r/min離心20min,收集上清液,保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 各種蛋白酶的最佳水解溫度和pHTable 1 The best hydrolysis time andthe best pH of different protease enzzymes

1.2.2 水解度(DH)的測(cè)定 采用茚三酮比色法[6]。

1.2.3 肽含量的測(cè)定方法 采用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定[9]。

1.2.4 酶解液清除DPPH·的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[10]，將2mL酶解液加1mL蒸餾水與3mL含0.1mmol/L DPPH的無(wú)水乙醇溶液混勻,25℃下避光反應(yīng)30min,4000r/min離心20min后測(cè)定在517nm處的吸光值A(chǔ)s;用無(wú)水乙醇代替DPPH無(wú)水乙醇溶液測(cè)吸光值A(chǔ)x;用蒸餾水代替酶解液測(cè)吸光值A(chǔ)c。

酶解液DPPH·清除率SA(%)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得到重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用one-wayANONA法分析各組數(shù)據(jù)結(jié)果之間是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶對(duì)羊胎盤的酶解效果

木瓜蛋白酶是一種具有廣泛特異性蛋白酶,其酶切位點(diǎn)為Arg-,Lys-,Phe-,X-。由圖1可知,整個(gè)水解進(jìn)行過(guò)程中DH值和肽含量一直增加,水解開(kāi)始4h內(nèi)增加比較快,4h時(shí)DH值達(dá)18.26%,肽含量為163.16mg。但水解4～6h之間,其DH值變化不大,當(dāng)水解6h后,DH值又迎來(lái)第二個(gè)迅速增長(zhǎng)期,9h時(shí)DH值為27.7%,肽含量為243.60mg。水解9h以后,DH值趨于平緩,可能是木瓜蛋白酶可作用的蛋白質(zhì)底物已經(jīng)被水解完全,所以隨著酶解的進(jìn)行,其水解度和肽含量變化不大。水解度和DPPH清除率并不是線性關(guān)系。水解8h的產(chǎn)物對(duì)DPPH清除率比較高,為42.48%。

圖1 木瓜蛋白酶酶解過(guò)程中DH值和肽含量的變化Fig.1 The change of DH and peptide yield by Papain

圖2 木瓜蛋白酶酶解過(guò)程中DPPH清除率的變化Fig.2 The change of scavenging rate of DPPH radical by Papain

2.2 復(fù)合蛋白酶對(duì)羊胎盤的酶解效果

復(fù)合蛋白酶是一種復(fù)合型的內(nèi)切蛋白酶,其酶切位點(diǎn)為Ala-,Leu-,Val-,Tyr-等。圖3中DH值和肽含量在整個(gè)酶解過(guò)程中一直增加,分別從10.97%增加到31.55%,125.56mg上升到207.54mg。說(shuō)明隨著DH值的增大,酶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)逐漸被分裂成肽。圖4酶解1h,產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除率為24.39%,已接近最大值,隨著酶解時(shí)間的增加,清除率出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

圖3 復(fù)合蛋白酶酶解過(guò)程中DH值和肽含量的變化Fig.3 The change of DH and peptide yield by Protamex

圖4 復(fù)合蛋白酶酶解過(guò)程中DPPH清除率的變化Fig.4 The change of scavenging rate of DPPH radical by Protamex

酶解1h后,反應(yīng)體系中存在大分子蛋白、對(duì)DPPH清除率高的抗氧化肽和氨基酸,這些成分在復(fù)合蛋白酶的作用下發(fā)生變化,這個(gè)過(guò)程比較復(fù)雜,存在多種轉(zhuǎn)化方式,但酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH清除率降低,說(shuō)明生成了IC50值比較少的羊胎盤抗氧化肽。可能由于隨著酶解的進(jìn)行,復(fù)合蛋白酶切斷了具有高抗氧化性的肽鏈,導(dǎo)致產(chǎn)物的DPPH清除率下降。該結(jié)果與李琳[11]利用鳙魚(yú)蛋白控制酶解制備抗氧化肽的結(jié)論一致,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH清除率降低,生成了IC50值比較少的羊胎盤抗氧化肽。

2.3 胰蛋白酶對(duì)羊胎盤的酶解效果

胰蛋白酶是一種絲氨酸內(nèi)切蛋白酶,僅能水解R1為精氨酸或賴氨酸殘基側(cè)鏈的肽鍵,而當(dāng)提供肽鍵的氨基酸為脯氨酸時(shí)水解受阻,難以繼續(xù)進(jìn)行。由圖5可知,經(jīng)過(guò)10h的酶解作用后,DH值由9.99%增加至36.41%,肽含量則在8h時(shí)達(dá)最高點(diǎn),為265.79mg,8h后出現(xiàn)下降。與其他蛋白酶相比,胰蛋白酶的DH值增幅最大,10h內(nèi)增加了26.4%,說(shuō)明胰蛋白酶能對(duì)羊胎盤進(jìn)行充分的水解,8h后其多肽含量下降,說(shuō)明酶解液中多肽被進(jìn)一步水解成氨基酸,圖6中,8h時(shí),產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除率達(dá)最大,為41.84%。結(jié)果表明,酶解8h時(shí),多肽含量最高,對(duì)DPPH清除率最大。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),肽含量逐漸下降,產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除率也下降,說(shuō)明羊胎盤酶解液中對(duì)DPPH有清除作用的主要來(lái)源于其多肽,游離氨基酸對(duì)DPPH的清除作用低。與其他蛋白酶相比較,胰蛋白酶表現(xiàn)了水解速率快的特點(diǎn)。

圖5 胰蛋白酶酶解過(guò)程中DH值和肽含量的變化Fig.5 The change of DH and peptide yield by Trypsin

圖6 胰蛋白酶酶解過(guò)程中DPPH清除率的變化Fig.6 The change of scavenging rate of DPPH radical by Trypsin

2.4 風(fēng)味蛋白酶對(duì)羊胎盤的酶解效果

風(fēng)味蛋白酶所含酶的種類復(fù)雜,其中包含內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶多種蛋白酶,其酶切位點(diǎn)為Arg-,Lys-,Leu-,Val-等。圖7中風(fēng)味蛋白酶對(duì)羊胎盤蛋白質(zhì)的水解度不高,產(chǎn)物的肽含量在整個(gè)酶解過(guò)程中增長(zhǎng)比較慢。酶解10h后,肽含量為131.55mg,含量不高。與其他蛋白酶相比較,風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的DH值比較低,可推測(cè)產(chǎn)物中含有較多的蛋白胨和大分子肽,其水解能力沒(méi)有得到充分利用,若能與其他酶復(fù)合使用可能會(huì)得到比較好的效果。

圖7 風(fēng)味蛋白酶酶解過(guò)程中DH值和肽含量的變化Fig.7 The change of DH and peptide yield by Flavourzyme

圖8中當(dāng)酶解進(jìn)行8h,最大清除率為50.00%,其次是酶解2h時(shí),清除率為48.23%。說(shuō)明羊胎盤抗氧化肽的分子量大小與其抗氧化性不成線性關(guān)系。由于風(fēng)味蛋白酶的組成復(fù)雜,其酶切位點(diǎn)較多,難以控制其酶解過(guò)程,因此在酶解的過(guò)程中,酶解產(chǎn)物的DPPH清除率變化規(guī)律不明顯。若與其他蛋白酶復(fù)配,將有利于控制酶解的過(guò)程,制備羊胎盤抗氧化肽。實(shí)際生產(chǎn)中基于生產(chǎn)成本的考慮,酶解2h產(chǎn)物的DPPH清除率能達(dá)48.23%,與8h時(shí)50.00%僅相差1%左右,但是卻能節(jié)約6h的燃料動(dòng)力費(fèi)。

圖8 風(fēng)味蛋白酶酶解過(guò)程中DPPH清除率的變化Fig.8 The change of scavenging rate of DPPH radical by Flavourzyme

2.5 堿性蛋白酶對(duì)羊胎盤的酶解效果

堿性蛋白酶是一種深度水解蛋白酶,圖9中酶解10h水解度DH值為34.41%,與其他的比較起來(lái)是比較高的。其肽含量從1h到10h也不斷增大,分別為186.44mg和252.65mg。說(shuō)明堿性蛋白酶對(duì)羊胎盤的酶解比較充分。圖10中產(chǎn)物的DPPH清除率都比較平緩,變化不大,并且相對(duì)于其他蛋白酶,其清除率均比較大。經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶的酶解作用,能產(chǎn)生較多的對(duì)DPPH具有較強(qiáng)清除率的蛋白肽,若堿性蛋白酶能與其他蛋白酶復(fù)合,有望進(jìn)一步提高產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除率。

圖9 堿性蛋白酶酶解過(guò)程中DH值和肽含量的變化Fig.9 The change of DH and peptide yield by Alcalase

圖10 堿性蛋白酶酶解過(guò)程中DPPH清除率的變化Fig.10 The change of scavenging rate of DPPH radical by Alcalase

2.6 中性蛋白酶對(duì)羊胎盤的酶解效果

中性蛋白酶是一種無(wú)特異性蛋白酶。圖11中DH值前6h增長(zhǎng)比較平緩,6h后迅速增長(zhǎng),從13.49%上升到23.43%。肽含量在酶解3h時(shí)為171.04mg,為最高點(diǎn),3h后即出現(xiàn)下降,當(dāng)酶解10h其多肽含量介乎于酶解開(kāi)始前2h,為86.23mg。圖12水解3h的產(chǎn)物對(duì)DPPH清除率比較高,為64.88%,酶解3h后,清除率逐漸下降,當(dāng)酶解10h,其清除率僅為15.12%。隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng),酶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)、多肽與酶作用的時(shí)間增長(zhǎng),分解為游離氨基酸。羊胎盤酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH清除率隨著酶解液中多肽含量的減少而降低,即多肽含量與對(duì)DPPH自由基的清除率有相關(guān)性,說(shuō)明對(duì)DPPH的清除作用主要來(lái)源于酶解液中的多肽,其結(jié)果與胰蛋白酶分析結(jié)果相似。

圖11 中性蛋白酶酶解過(guò)程中DH值和肽含量的變化Fig.11 The change of DH and peptide yield by Neutrase

圖12 中性蛋白酶酶解過(guò)程中DPPH清除率的變化Fig.12 The change of scavenging rate of DPPH radical by Neutrase

2.7 水解蛋白酶對(duì)羊胎盤的酶解效果

水解蛋白酶是一種無(wú)特異性蛋白酶,圖13與圖9相似,DH值都比較大,酶解10h過(guò)程中,DH值從24.51%增加到37.49%,其肽含量也從178.92mg增加到273.68mg。說(shuō)明水解蛋白酶對(duì)羊胎盤的酶解比較充分,適合用于制備羊胎盤小肽。圖14中清除率的變化與圖13中的DH值和肽含量變化的對(duì)應(yīng)關(guān)系不強(qiáng),從圖14中可以看出,水解蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH清除率并沒(méi)有特別高,最大值為39.91%,整個(gè)酶解過(guò)程中DPPH清除率表現(xiàn)出高低起伏的特點(diǎn),這現(xiàn)象可用水解蛋白酶無(wú)特異作用酶切位點(diǎn)來(lái)解釋,由于水解蛋白酶酶切位點(diǎn)不專一,對(duì)肽鏈的作用存在多種選擇性,小分子肽的組分發(fā)生比較大的變化,其酶解過(guò)程難以控制。

圖13 水解蛋白酶酶解過(guò)程中DH值和肽含量的變化Fig.13 The change of DH and peptide yield by Proteolytic enzyme

圖14 水解蛋白酶酶解過(guò)程中DPPH清除率的變化Fig.14 The change of scavenging rate of DPPH radical by Proteolytic enzyme

2.8 菠蘿蛋白酶對(duì)羊胎盤的酶解效果

菠蘿蛋白酶是從菠蘿果莖、葉、皮提取出來(lái),經(jīng)精制、提純、濃縮、酶固定化、冷凍干燥而得到的一種純天然植物蛋白酶,是一種無(wú)特異性蛋白酶。由圖15中可以看出,菠蘿蛋白酶對(duì)羊胎盤酶解的過(guò)程中,DH值和肽含量趨勢(shì)一致,前4h上升比較快,4～9h緩慢增長(zhǎng),9h后快速上升,整個(gè)過(guò)程中均保持上升狀態(tài)。但是最終的DH值和多肽含量并不高,分別為28.99%和211.63mg。表明菠蘿蛋白酶對(duì)羊胎盤酶解效率比較低,酶解10h仍有大分子蛋白質(zhì)和蛋白胨存在。圖16中DPPH清除率在前4h隨著多肽含量的增加而增大,4h后DPPH清除率趨于穩(wěn)定。與其他蛋白酶相比,菠蘿蛋白酶對(duì)羊胎盤的酶解產(chǎn)物的DPPH清除率比較低,最高僅達(dá)35.26%。

圖15 菠蘿蛋白酶酶解過(guò)程中DH值和肽含量的變化Fig.15 The change of DH and peptide yield by Bromelain

圖16 菠蘿蛋白酶酶解過(guò)程中DPPH清除率的變化Fig.16 The change of scavenging rate of DPPH radical by Bromelain

3 結(jié)論

3.1 對(duì)于不同的酶解過(guò)程,作用酶不同,酶解產(chǎn)物中肽的組成不同,對(duì)DPPH清除率差異較大,需要對(duì)酶解過(guò)程中DPPH清除率的變化進(jìn)行分析,控制酶解制備羊胎盤抗氧化肽。其中風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)羊胎盤控制酶解制備抗氧化肽的效果比較好,酶解產(chǎn)物(稀釋100倍)的最大DPPH清除率分別為酶解8h清除率50.00%,酶解1h清除率38.67%和酶解3h清除率64.88%。三種酶酶解3h的產(chǎn)物對(duì)DPPH清除的IC50分別為0.6420、0.7120和0.6781mg/mL。酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除率比較明顯。

3.2 使用單一的蛋白酶難以提高最終的水解度,對(duì)蛋白質(zhì)酶解不充分。八種蛋白酶對(duì)羊胎盤進(jìn)行酶解,其水解度基本在30%～40%,不超過(guò)50%,建議采用風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶解以提高羊胎盤蛋白的水解程度,充分利用其蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的酶解過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),酶解產(chǎn)物的DPPH清除率可能出現(xiàn)下降,酶解體系中的抗氧化肽可被酶解。酶解時(shí)間、水解度與DPPH清除率之間不存在漸增或漸減的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

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Study on producting antioxidant peptide fromgoat placenta by different proteases

ZHOU Jie-jing,HOU Yin-chen,LIU Wang-wang,XIAO Lin,YANG Gong-ming*

(College of Food,South China Agricultural University,Guangzhou 510640,China)

Study on production antioxidant peptides from goat placenta by proteases on hydrolysis of degree,peptide yield and a evaluation of scavenging rate of DPPH radical. Hydrolysis by eight proteases which under their optimal conditions.The results showed that the scavenging rate of DPPH radical of Flavourzyme,Alkaline and Neutrase were 0.6420、0.7120mg/mL and 0.6781mg/mL respectively. Flavourzyme,Alkaline and Neutrase were the best enzyme to product antioxidant peptide from goat placenta.

enzymatic hydrolysis;goat placenta;antioxidant peptide;hydrolysis of degree;scavenging rate of hydrolysate to the DPPH radical

2014-05-27

周潔靜(1989-)，女，在讀碩士，研究方向：食品加工、貯藏和包裝。

*通訊作者:楊公明(1950-)，男，博士，教授，研究方向：食品加工、保藏與食品機(jī)械。

廣東省粵港招標(biāo)項(xiàng)目(2006498620)。

TS251.5

A

1002-0306(2015)05-0156-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.024