腸道氨基酸和小肽轉運載體的基因表達、影響因素與分子調控機制

黃薪蓓 許慶彪 劉建新

(浙江大學動物科學學院奶業(yè)科學研究所，動物分子營養(yǎng)學教育部重點實驗室，杭州 310058)

飼糧來源氨基酸、脂肪酸和碳水化合物為動物體提供必需的營養(yǎng)物質，其吸收受多種機制的調節(jié)以保持穩(wěn)衡。很長一段時間，人們相信蛋白質在腸腔被完全水解成氨基酸，然后通過氨基酸轉運載體吸收入機體。然而，在20世紀70年代，研究發(fā)現(xiàn)含2個和3個氨基酸的小肽是蛋白質水解的主要產物［1］，隨后開始了相應轉運系統(tǒng)的研究。迄今已有許多試驗證明腸道氨基酸轉運載體和小肽轉運載體的存在，它們的表達及轉運功能受許多因素的調節(jié)，包括飼糧、發(fā)育、激素、microRNAs(miRNAs)以及其他一些蛋白因子。由于反芻動物消化道結構的特殊性，其氨基酸和肽的轉運更為復雜。因此，闡明腸道氨基酸和肽轉運及其調節(jié)機制有助于更清楚了解腸道蛋白質的消化和吸收過程，為生產實踐提供理論依據。

1 腸道小肽和氨基酸轉運系統(tǒng)

腸道氨基酸的轉運受氨基酸轉運載體調節(jié)，而小肽的吸收則受小肽轉運載體(PepT1和PepT2)的調節(jié)。氨基酸的轉運存在底物專一性，但是小肽轉運不存在這種專一性，PepT1可以轉運400種二肽和8 000種三肽，并且轉運1個二肽或三肽所需能量與1個游離的氨基酸是一樣的。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種小肽轉運載體(H+依賴型和非H+依賴型)、8種氨基酸轉運系統(tǒng)和1種H+依賴型的氨基酸轉運載體。多種載體在腸道基底膜和刷狀黏膜表達，一部分僅在其他器官表達。

1.1 小肽轉運載體

目前研究最多的小肽轉運載體是PepT1和PepT2。Chen等［2］通過試驗證實了小肽轉運載體在羊、牛、豬和雞等家養(yǎng)動物的組織分布，開拓了營養(yǎng)生理的新領域。2種小肽轉運載體(PepT1和PepT2)的cDNAs序列已經被測定，功能分析表明2種載體具有不同的底物親和性和特異性。PepT1和PepT2的組織分布也存在差異:PepT1主要在腸道表達，在反芻動物的瘤胃和瓣胃也有表達［3］，而PepT2主要在腎臟表達。小肽轉運載體是質子依賴性的，例如PepT1吸收了肽和H+后，質子被鈉氫交換器轉出細胞，胞內的Na+再被鈉鉀交換器轉出，轉出 3個 Na+，轉入 2個 K+以恢復電化學梯度。

1.2 氨基酸轉運系統(tǒng)

近年來氨基酸轉運載體的研究取得了顯著進展，目前已鑒定出的包括6類陰性、4類陽性、11類中性以及5類兼性氨基酸轉運載體。氨基酸的轉運被稱為“系統(tǒng)轉運”，表明各種細胞類型的轉運活動相似。氨基酸轉運載體有系統(tǒng)命名，如中性氨基酸轉運系統(tǒng)(L、A和ASC系統(tǒng))、酸性氨基酸轉運系統(tǒng)(系統(tǒng))、堿性氨基酸轉運系統(tǒng)(y+系統(tǒng))和一些特殊的氨基酸轉運載體(L和T系統(tǒng))。兩性氨基酸轉運載體有3種:丙氨酸/絲氨酸/半胱氨酸/蘇氨酸轉運蛋白(ASCT)1、ASCT2和B0，其中B0主要在上皮中表達，只依賴Na+而不需要與K+相互作用。氨基酸轉運載體y+L和b0，+的蛋白鏈 rBAT、b0，+AT、4F2hc 和 y+LAT1 在腸道都有分布，是非Na+依賴型的堿性及兩性氨基酸轉運載體，依靠氨基酸交換進行。酸性氨基酸轉運載體有5種:興奮性氨基酸轉運蛋白(EAAT)1～5，其中EAAT3主要在腸上皮細胞表達;EAAT是Na+共轉運載體，在轉運過程中同時需要偶聯(lián)K+的反向轉運。堿性氨基酸轉運載體在家養(yǎng)動物中研究較多，主要是由于其與賴氨酸的吸收轉運有關。y+轉運系統(tǒng)是細胞中為數極少的單向轉運系統(tǒng)，位于上皮細胞基底部，其驅動力主要是膜兩側的電勢梯度。y+系統(tǒng)有4個氨基酸轉運蛋白:陽離子氨基酸轉運蛋白(CAT)1、CAT2、CAT2a和CAT3，CAT1是多種細胞中最主要的y+系統(tǒng)轉運蛋白，幾乎在所有的組織中存在(除肝臟外)，而肝臟僅表達 CAT2a［4］。

2 小肽和氨基酸轉運載體基因表達調節(jié)的分子機制

某些氨基酸(亮氨酸和苯丙氨酸)能通過氨基酸反應元素(AARE)介導來控制鼠PepT1的啟動子活性。AARE樣模體位于起始密碼子上游，并且與天冬酰胺合成酶的AARE有較高同源性，位于起始密碼子上游有一個尾側型同源轉錄因子2(Cdx2)結合位點。對鼠啟動子的系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)了轉錄起始位點上游內的相關順式和反式元素，包括連接轉錄因子Sp1的3個GC盒子［5］，它們的直接作用是對哺乳動物PepT1表達的調節(jié)。有研究報道，腸道PepT1的表達受Cdx2的調控，盡管Cdx2的結合位點還不確定，而Cdx2的結合依賴于轉錄因子 Sp1 以及丁酸鹽［6-7］。Saito 等［8］發(fā)現(xiàn)小鼠PepT1轉錄的節(jié)律性調節(jié)依靠時鐘基因控制的白蛋白D位點結合蛋白。

氨基酸轉運載體的mRNA轉錄需要第1外顯子處的1個氨基酸反應元素，此外，還受轉錄因子蛋白激酶GCN2(使真核啟動因子2α磷酸化)的激活，表明有新翻譯的轉錄因子參與轉錄。氨基酸饑餓時，3＇末端非編碼區(qū)遠端片段內RNA結合蛋白(HuR)定位發(fā)生改變，導致氨基酸轉運載體的mRNA穩(wěn)定性增加，但HuR的細胞質定位的機制尚不清楚，該反應的氨基酸特異性也不清楚，可能與AMP激酶有關。氨基酸轉運載體mRNA的翻譯從一個5＇末端非編碼區(qū)的內部核糖體進入位點(IRES)開始，其有效的翻譯還要求真核啟動因子2α的磷酸化，通過轉錄因子蛋白激酶GCN2、蛋白激酶樣的內質網激酶或者雙鏈RNA依賴蛋白激酶起作用，而IRES的調節(jié)活動依賴于一個位于5＇末端非編碼區(qū)的上游開放讀碼框(48個氨基酸的IORF)和IRES的重疊部分［9］。氨基酸饑餓通過真核啟動因子2α磷酸化起作用，由此推測引起真核啟動因子2α磷酸化的物質都可以誘導氨基酸轉運載體的IRES活性，內質網應激可以引起其IRES活性增加驗證了這一推測。所以營養(yǎng)缺乏，像氨基酸和葡萄糖不足(會引起內質網應激)，會激活下游目標氨基酸合成基因、氨基酸轉運載體基因和轉錄因子等的信號通路［10］。不僅如此，許多證據表明氨基酸轉運載體蛋白可在翻譯后被調節(jié)，激活的蛋白激酶C致其轉錄活性顯著下調，這個過程是由轉運載體的內化引起，不是直接磷酸化的結果，但其具體機制還不清楚。小肽和氨基酸轉運載體的表達調節(jié)分子機制多在試驗動物上研究，對于農業(yè)動物的研究較少，并且其表達受許多因素的影響，相對應的各種調節(jié)機制仍未完全清楚。

3 影響小肽和氨基酸轉運載體表達的因素

3.1 發(fā)育過程

在不同的發(fā)育階段，動物腸道小肽和氨基酸轉運載體的表達不同。Guandalini等［11］發(fā)現(xiàn)新生兒腸道更易吸收小肽。大鼠出生4 d后PepT1的mRNA水平顯著增加，而后開始下降，在28 d達到成年水平。近年的研究表明，大鼠十二指腸、空腸、回腸PepT1的mRNA表達量在出生后第3～5天達到最大，然后下降，而斷奶時(第24天)會出現(xiàn)短暫的上升。但Rome等［12］報道PepT1在小腸的表達不隨大鼠的年齡變化而變化。有學者認為，飼糧蛋白質和一些神經激素(甲狀腺素、胰島素和糖皮質激素等)可能參與了PepT1在發(fā)育階段的表達調控，但具體機制仍不清楚，需要進一步深入研究。

Buddington等［13］研究發(fā)現(xiàn)，豬的氨基酸吸收率從出生開始逐漸下降，24 h下降30%，可能原因是氨基酸轉運蛋白下降、轉運載體周轉速率變化以及不同氨基酸轉運載體的替換。同時氨基酸轉運載體隨著發(fā)育變化，與物種及載體本身密切相關。Liao等［14］發(fā)現(xiàn)牛不同發(fā)育階段的CAT1在腸道的表達有所不同，在生長期空腸CAT1的mRNA表達豐度顯著高于哺乳、斷奶和育肥期，且顯著高于十二指腸和回腸;在其他3個階段不同腸段間CAT1的mRNA表達豐度差異不顯著，表明CAT1介導的堿性氨基酸吸收最大量出現(xiàn)在肉牛的生長階段。Feng等［15］對豬腸道不同時期 b0，+AT 和y+LAT1的mRNA表達變化規(guī)律進行研究，發(fā)現(xiàn)mRNA豐度隨日齡呈線性增加，可能與飼糧的改變及氨基酸需求量增加有關。綜上所述，隨著腸道組織總重量增加，氨基酸轉運載體總體轉運能力增強，而單位面積腸道組織對大部分氨基酸的轉運能力則是下降的。目前的研究僅限于幾種氨基酸轉運載體，還有很多重要的氨基酸轉運載體有待進一步研究，尤其是反芻動物。

3.2 跨膜質子流及細胞內p H

PepT1的轉運功能依賴跨膜質子梯度以及內部的負膜電位。野生型鼠試驗發(fā)現(xiàn)，吸收甘氨酸-肌氨酸二肽后腸上皮細胞內pH降低，而PepT1缺失鼠則無此現(xiàn)象，表明PepT1具有酸轉運載體的功能［16］。為了防止細胞酸化，Na+/H+交換器排出中性的質子交換細胞外的Na+。PepT1對其他質子依賴性營養(yǎng)物質的轉運也有調節(jié)作用，PepT1表達減少可導致細胞內pH升高，從而增加脂肪沉積［17］。然 而，Kolodziejczak 等［18］研 究 發(fā) 現(xiàn)，給PepT1缺失小鼠飼喂高脂肪飼糧，由于PepT1的缺失可導致小鼠不能通過增加絨毛長度和面積來適應高脂肪的飼糧，日增重和脂肪沉積都顯著減少，其影響結果可能取決于PepT1減少的程度，但可以確定的是，PepT1的正常工作依賴于細胞內適宜的pH。

Na+依賴的氨基酸轉運載體不受pH變化的影響，如精氨酸的轉運受賴氨酸、鳥氨酸或者高精氨酸的調節(jié)，其他相關的研究還比較欠缺。腎上皮細胞的ASCT2具有Na+依賴性，用Li+替代Na+時表現(xiàn)出較低的耐受性，中性氨基酸和谷氨酸鹽在pH為7時達到最大轉運水平［19］。

3.3 激素和蛋白因子

PepT1的表達豐度和活性受到激素的調節(jié)，比如胰島素、瘦素、生長激素以及甲狀腺激素。用胰島素處理Caco-2細胞，二肽的攝入會增加，Vmax增加而Km不變，說明胰島素是通過增加PepT1的豐度來提高二肽攝入量的。腸腔內的瘦素可以促進小肽的吸收［21］，它們并非在轉錄水平上改變PepT1的轉運活性，具體機制尚不清楚。Avissar等［22］發(fā)現(xiàn)生長激素和表皮生長因子也可促進PepT1的mRNA在空腸的表達豐度。Ashida等［23］用三碘甲狀腺原氨酸(T3)處理Caco-2細胞后，PepT1的mRNA豐度和蛋白質數量都顯著減少，可能是T3使PepT1的mRNA的轉錄或穩(wěn)定性下降，其機理可能是與細胞核靶基因調節(jié)區(qū)域的甲狀腺激素反應元件(TRE)相互作用，形成甲狀腺受體復合物間接地影響其轉錄。蛋白激酶C(PKC)和環(huán)化腺苷酸(cAMP)也可調節(jié)PepT1的表達，但還不清楚這種調節(jié)是通過特異基因相互作用、細胞信號或轉運載體的功能起作用，還是激素來本身調節(jié)而實現(xiàn)。

氨基酸轉運載體的表達受許多蛋白因子的影響。用血小板生長因子(PDGF)、溶血卵磷脂(LPC)、轉化生長因子β(TGF-β)短期處理均可以下調CAT的轉運。然而，是否由于CAT的表達量降低還有待證明，也可能是由于亞細胞定位、轉運活性或者底物親和力的改變引起。Uchiyama等［24］在Caco-2細胞上的研究發(fā)現(xiàn)，S-亞硝基-N-乙酰-DL-青霉胺可通過從頭合成增加ASCT2的蛋白質表達量。Fanjul等［25］的試驗表明，瘦素可以控制ASCT2和B0AT1的活性。氨基酸轉運載體種類眾多，當前的研究僅限于某幾種氨基酸，尚需深入研究以發(fā)現(xiàn)更多的影響因子。

3.4 miRNAs

miRNAs是轉錄后抑制目標基因表達的非編碼RNAs，最近發(fā)現(xiàn)它們有許多細胞功能，在哺乳動物中，miRNAs控制著將近30%的蛋白質編碼基因，幾乎參與所有細胞進程的調控，許多miRNAs具有組織表達特異性，而且它們的表達形式可導致器官蛋白質圖譜出現(xiàn)特異。在腸道上皮分化期間miR-194發(fā)生上調，miR-7也對腸道上皮細胞的分化起作用［26-27］。Dalmasso 等［28］以 Caco-2 細胞系為模型，發(fā)現(xiàn)在上皮細胞分化期間PepT1的表達水平與成熟的miR-92b呈負相關，并且從轉錄和翻譯水平進行調節(jié)，其機理是作用于PepT1的3＇端的非翻譯區(qū)。

氨基酸轉運載體也受miRNAs的調節(jié)，在肝細胞中，miR-122可能下調高親和力的堿性氨基酸轉運載體CAT1，靶向結合mRNAs的3’端的非翻譯區(qū)阻止蛋白質的積累，其機制是抑制轉錄或誘導mRNAs的降解［29］。作為新的調控因子，miRNA的研究還處于初級階段，尤其在農業(yè)動物上的研究更為有限，對腸道氨基酸和小肽轉運載體的調節(jié)方面的研究也很欠缺，值得深入探索其調控途徑和分子機制。

4 飼糧氮水平對小肽和氨基酸轉運載體的調控作用

眾所周知，腸道營養(yǎng)物質轉運載體的表達和功能由營養(yǎng)供應引發(fā)與調控。氨基酸是細胞合成小肽和蛋白質的前體物質，因此腸腔內氨基酸以小肽的形式吸收的量與氨基酸或小肽的濃度密切相關。從畜牧業(yè)的角度來看，飼糧蛋白質資源不足且較為昂貴，其利用率即使較小幅度的改善也可有效提高經濟效益，并減少氮的排放，改善環(huán)境。

4.1 低氮水平

Ogihara等［30］利用免疫熒光染色進行免疫印跡和圖像分析檢測了飼糧氨基酸添加及饑餓對小鼠空腸PepT1表達的影響，發(fā)現(xiàn)饑餓顯著增加PepT1載體蛋白的表達量。此外，多種動物試驗表明，短期禁食可以增加小肽轉運載體的表達量，這依賴于過氧化物酶體增殖因子激活受體α(PPARα)。給 PPARα缺失小鼠短期禁食時，PepT1載體蛋白的表達量與自由采食的小鼠相比沒有差異;在鼠禁食1 d后可增加二肽的轉運，其機制可能是增加了 PepT1基因表達［31］。Gilbert等［32］給雞飼喂低蛋白質飼糧，3～7 d PepT1表達量減少，7～14 d表達量增加。Hatzoglou等［33］發(fā)現(xiàn)給大鼠禁食氨基酸不僅可增加CAT1的轉錄水平，還提高了mRNA的穩(wěn)定性和翻譯水平。

4.2 高氮水平

Walker等［34］利用 Caco-2 細胞系試驗發(fā)現(xiàn)，添加小肽可增加PepT1 mRNA的表達量。Ferraris等［35］給鼠飼喂高蛋白質飼糧，發(fā)現(xiàn)空腸對二肽的轉運能力增強。在雞的試驗中得到了相似結果，增加飼糧中的蛋白質含量，PepT1 mRNA表達量從3～14 d持續(xù)增加。

氨基酸的轉運依賴底物特異性的不同轉運系統(tǒng)。b0，+系統(tǒng)通過亮氨酸交換來轉運賴氨酸，飼糧中亮氨酸的濃度會影響堿性氨基酸的吸收。García-Villalobos等［36］在賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸缺乏的飼糧中添加相應氨基酸增加了空腸中b0，+的表達量，血清中的賴氨酸濃度升高;Morales等［37］發(fā)現(xiàn)在生長豬的飼糧中額外添加亮氨酸影響b0，+在空腸的表達量;He 等［38］在斷奶仔豬的飼糧中添加賴氨酸，顯著增加了空腸腸絨毛的高度和隱窩的深度，b0，+AT和y+LAT1的mRNA表達量也顯著升高。而Liao等［39］發(fā)現(xiàn)，增加腸腔微生物蛋白產量會降低腸細胞頂膜和底膜對堿性氨基酸的轉運能力。飼糧賴氨酸含量選擇性地影響小腸堿性氨基酸轉運載體的表達，從而影響其對賴氨酸和其他必需氨基酸的吸收，但其具體的調節(jié)機制還有待深入研究。值得注意的是，由于氨基酸轉運載體依賴離子交換進行轉運，小肽轉運入細胞水解成大量氨基酸可以促進氨基酸的轉運，游離氨基酸的吸收受PepT1的間接調控。Wenzel等［40］研究發(fā)現(xiàn)，二肽的吸收可促進 bo，+系統(tǒng)對氨基酸的吸收。

這些結果表明，蛋白質的消化產物可以作為代謝信號調節(jié)PepT1基因的轉錄，底物過量或缺少都會增加PepT1基因的表達。當底物濃度較高時會增加載體的表達以充分吸收利用底物，而在低濃度時，作為補償機制增加載體表達。氨基酸的情況則比較復雜，因為可以用作能量來源，一些氨基酸對某種細胞更為重要或毒性作用更強，并且一些氨基酸轉運載體轉運相同的底物，而一些則同時轉運必需和非必需氨基酸，因此很難預測添加或缺少某種氨基酸對轉運載體的影響作用。

5 小結

近年來，氨基酸和小肽轉運載體被成功克隆表達，其分子結構、組織分布和功能也得到了大量研究，為蛋白質營養(yǎng)的研究開辟了廣闊的空間。深入探討影響其基因表達和功能的因素及其作用機制，可以更好地應用其獨特的生物學功能，在生理學研究和動物生產實踐上都有重要的意義。雖然對于氨基酸和小肽轉運載體活性的調節(jié)因素已有了不少研究，但其分子水平上的調節(jié)機制依然不是很清楚。同時研究多局限于試驗動物及在人類的生物制藥開發(fā)應用方面，而對于為人類提供肉、蛋、奶等畜禽類的研究還比較缺乏，尤其是在反芻動物方面的報道更為少見，值得深入研究。

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