4-硝基喹啉-1-氧化物誘導(dǎo)C57BL/6小鼠舌黏膜癌變的研究

代曉明 劉華 左志斌 秦少華 阮永華 李逸松

1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科頜面組，昆明 650032；2.云南省第二人民醫(yī)院口腔頜面外科，昆明 650021；3.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，昆明 650500

口腔鱗狀細(xì)胞癌（以下簡稱口腔癌）是人類最常見的惡性腫瘤之一，在我國舌癌居口腔癌的首位[1-4]。缺乏早期特異性診斷標(biāo)志物以及有效的治療靶點是舌癌患者臨床治療效果不佳的主要原因[5]。獲得理想的舌癌動物模型是解決上述問題的關(guān)鍵。二甲基苯并蒽（9,10-Dimethyl-benzanthrancene，DMBA）誘導(dǎo)金黃地鼠（Syrian hamster）口腔癌模型在20世紀(jì)50年代已有報道[6]。4-硝基喹啉-1-氧化物（4-nitroquinoline 1-oxide，4NQO）誘導(dǎo)大鼠黏膜癌變被認(rèn)為是更加理想的口腔癌動物模型[7]。本課題組擬對4NQO誘導(dǎo)C57BL/6小鼠舌黏膜癌變的規(guī)律和特點進(jìn)行研究，為后續(xù)舌癌的發(fā)病機(jī)制研究及找尋新防治靶點提供可靠的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

85只雌性C57BL/6小鼠，SPF級，體質(zhì)量為18～20 g，鼠齡30～50 d，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.2 實驗試劑及設(shè)備

4NQO（Sigma公司，美國），用1,2丙二醇配置成500 mg·L-1，避光保存于4 ℃冰箱備用。1,2丙二醇分析純（西隴化工股份有限公司），光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本），生物組織脫水機(jī)（TS-12J型，孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），生物組織包埋機(jī)（BM-VI型，孝感電子儀器廠），組織切片機(jī)（Leica2235型，Leica公司，德國），圖片采集系統(tǒng)（BX-51型顯微鏡，奧林巴斯公司，日本）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 將85只C57BL/6小鼠分為3組：蒸餾水對照組（n=5），1,2丙二醇對照組（n=5），實驗組（n=75）。75只實驗組小鼠再隨機(jī)分為15籠，每籠5只，并對每籠進(jìn)行標(biāo)記，即第0周對應(yīng)第1籠，第2周對應(yīng)第2籠，第4周對應(yīng)第3籠，以此類推，第28周對應(yīng)第15籠。實驗開始時（第0周，W=0）處死實驗組第1籠小鼠，之后每2周處死1籠實驗組小鼠，直至28周。其余2個對照組小鼠于28周處死。處死小鼠前，對小鼠以部位（頭、臂、背、腰、尾）進(jìn)行標(biāo)記。

1.3.2 給藥方式 1）實驗組：用蒸餾水稀釋1,2丙二醇配置的4NQO至終濃度為50 mg·L-1，置于避光瓶內(nèi)作為飲用水供自由飲用至16周，16周后換為蒸餾水繼續(xù)喂養(yǎng)，至28周實驗結(jié)束。2）1,2丙二醇對照組：按照與4NQO組含有相同濃度的1,2丙二醇水溶液喂養(yǎng)至16周，16周后換為蒸餾水繼續(xù)喂養(yǎng)，直至28周實驗結(jié)束。3）蒸餾水對照組：將蒸餾水置于透明塑料瓶中自由飲用。

1.3.3 實驗觀察 1）大體觀察：每3 d觀察小鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)、飲食、飲水及排便情況。每2周稱取體質(zhì)量，直至處死。處死后觀察小鼠口腔黏膜變化情況、拍攝照片。2）組織病理學(xué)：使用斷頭法處死實驗組小鼠，小鼠被處死后將新鮮舌組織切下，測量、觀察標(biāo)本的大體病變情況，并將舌由中線處縱向均等切為兩半，一份放置于10%甲醛溶液中保存，另一份迅速放入液氮速凍，再轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，以作后續(xù)分析。待所有小鼠處死后，從0、4、8、12、16、20、24、28周實驗組及蒸餾水對照組、1,2丙二醇對照組小鼠舌組織中，各隨機(jī)選取3個制作石蠟切片。組織常規(guī)包埋，連續(xù)切片（切成4 μm蠟帶）直至剩余組織不能再切為止，選擇有完整組織樣的蠟帶使用。常規(guī)蘇木精-伊紅（haematoxylineosin，HΕ）染色。病理診斷參照WHO 2005年的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、LSD-t及χ2檢驗。

2 結(jié)果

實驗組1只小鼠在實驗第2周時不明原因死亡，實驗結(jié)束時可評價小鼠84只。

2.1 大體觀察

全身狀況：對照組小鼠在整個實驗過程中活動程度、精神狀態(tài)、飲食、排便正常，小鼠體質(zhì)量隨實驗進(jìn)行緩慢增長。實驗組小鼠在實驗早期精神狀態(tài)、活動能力及飲食、飲水正常，實驗后期（25周時）部分小鼠出現(xiàn)行動遲緩、呆滯、喜蜷縮于角落、發(fā)抖、毛色不再光亮等病態(tài)狀況；體質(zhì)量在早期逐漸上升，至12周時達(dá)到最高水平，隨后呈現(xiàn)下降趨勢。在4、6、8、24、26、28時3組間的小鼠體質(zhì)量有統(tǒng)計學(xué)差異，實驗組24周后體質(zhì)量較對照組明顯降低（圖1，P<0.05）。其中，2個對照組間體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異，實驗組與對照組間有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 口腔黏膜

對照組：動物口腔黏膜光滑呈淡粉紅色，富彈性，無斑塊、顆粒、潰瘍、糜爛及增生物等病變形成。實驗組：第8周出現(xiàn)白色斑塊樣病損，第10周出現(xiàn)顆粒樣病變，第14周舌背出現(xiàn)突起物。病變的數(shù)量隨實驗進(jìn)程逐漸增加，24周時達(dá)到最多。實驗動物的舌、口底、上腭、頰部共出現(xiàn)79處肉眼可見的病變，其中舌部病變70處（88.6%），口底、上腭、頰部分別為3、2、4處，共占11.4%（圖2～4）。

圖1 小鼠不同時期體質(zhì)量變化Fig 1 Variantion of mice weight during experience

圖2 小鼠頰部（鑷子尖端）、舌尖（鑷子尖端下方）肉眼可見新生物Fig 2 Mess occurred on bucca(at the tip of forceps)and tongue(below the tip of forceps)

圖3 24周舌多發(fā)病灶Fig 3 Lingual multiple lesions at 24 week

圖4 肉眼觀察實驗組小鼠不同時期口腔黏膜病變數(shù)量Fig 4 Quantity of mucosal lesions by macroscopic observation during experience

2.3 組織病理學(xué)

對照組未見病變，實驗組動物在不同時間點黏膜病變不同（圖5，6）。

圖5 舌黏膜病理變化 HΕ× 400Fig 5 Pathological results of lingual mucosal lesions HΕ× 400

圖6 實驗組不同時期病理診斷結(jié)果Fig 6 Pathological results in experiment group

實驗組動物第8周出現(xiàn)單純性增生和輕度異常增生，第12周出現(xiàn)中度異常增生，第16周出現(xiàn)重度異常增生，第20周出現(xiàn)原位癌，第24周出現(xiàn)早期浸潤癌。28周時均發(fā)生高分化鱗狀細(xì)胞癌。所有的癌變組織均被診斷為高分化鱗狀細(xì)胞癌，未見有中、低分化鱗癌。

將單純性增生、輕度異常增生、中度異常增生歸為早期病變，重度異常增生、原位癌、早期浸潤癌歸為中晚期病變。在12周與16周時實驗組黏膜病變無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.196），16周與20周時有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.003），20、24、28周時無統(tǒng)計學(xué)差別（P=0.071）。

3 討論

建立口腔癌動物模型的方法主要有化學(xué)藥物誘導(dǎo)法、移植瘤法、轉(zhuǎn)基因法。移植瘤法是將活體腫瘤組織植入小鼠及裸鼠口腔內(nèi)達(dá)到誘導(dǎo)口腔癌的發(fā)生。其缺點是需要將大量腫瘤細(xì)胞或組織植入皮下或肌肉內(nèi)，移植后腫瘤發(fā)生率及轉(zhuǎn)移率易受到宿主機(jī)體免疫功能的影響。轉(zhuǎn)基因法是將外源重組基因轉(zhuǎn)染并整合到動物受體細(xì)胞基因組中或抑制/敲除動物的特定基因，從而增強或失活某些基因的表達(dá)。該技術(shù)存在轉(zhuǎn)錄效率低、轉(zhuǎn)基因在宿主基因中的行為難以控制及轉(zhuǎn)基因不能正常表達(dá)等缺點。

20世紀(jì)中期采用化學(xué)藥物DMBA成功誘導(dǎo)了金黃地鼠頰囊癌變[6]，然而該模型與人類口腔癌相比存在明顯的差別。在解剖上，人類口腔中沒有頰囊這一解剖結(jié)構(gòu)，地鼠頰囊免疫排異功能較差，可接受同種異體組織移植；在組織學(xué)上，地鼠頰囊黏膜較人類口腔黏膜更薄，且黏膜固有層包含結(jié)締組織；在腫瘤的演化進(jìn)程上，DMBA誘導(dǎo)的癌變發(fā)生在藥物持續(xù)刺激的過程中，從而使得因藥物接觸導(dǎo)致的黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生的可逆變化和真正的不可逆的癌前病變無法區(qū)分，而人類口腔癌的發(fā)生被認(rèn)為是致癌物間斷性刺激導(dǎo)致細(xì)胞突變的逐漸累積，最終進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的癌變進(jìn)程。DMBA誘導(dǎo)鱗癌的發(fā)生經(jīng)過乳頭狀瘤這一過程，而人類鱗癌卻很少發(fā)生在乳頭狀瘤之后。4NQO誘導(dǎo)的大鼠、小鼠口腔黏膜癌模型與DMBA誘發(fā)金黃地鼠頰囊癌模型相比有以下4個優(yōu)點。1）無論小鼠還是大鼠口腔黏膜在解剖和組織結(jié)構(gòu)上與人類更相似。2）4NQO無論通過溶于水飲用還是局部涂抹，均可導(dǎo)致黏膜癌變。這一過程與人類口腔癌的發(fā)生是平行的，即黏膜發(fā)育不良的病理改變是由于長期小劑量攝入致癌物所致[7]。3）4NQO對黏膜無刺激，在誘癌早期不產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，不影響對早期病理變化的診斷。4）誘癌過程經(jīng)歷增生、發(fā)育不良和高分化鱗癌等階段，與人口腔癌的發(fā)生過程相似。

不同給藥濃度和給藥時間對腫瘤的誘導(dǎo)結(jié)果有影響。Chang等[8]用200 mg·L-14NQO給藥8周后，在第28周時成功誘導(dǎo)出舌癌。李晶等[9]利用200 mg·L-14NQO給藥17～20周，在24周時誘導(dǎo)出小鼠胃及食道癌，而舌黏膜僅見中度異常增生。本實驗利用終濃度為50 mg·L-1的4NQO給藥16周，C57BL/6小鼠28周時的誘癌成功率為100%。腫瘤誘發(fā)的進(jìn)程及結(jié)果與其他學(xué)者[10]的相似。本研究中實驗動物的損失率僅為1.2%（1/85）。盡管給藥時間較長，但由于采用自由飲水法，故所需操作并不復(fù)雜。

本實驗?zāi)[瘤的誘導(dǎo)從小鼠8周齡開始，24～28周時腫瘤形成。該過程跨越動物的生長期（出生后4～8周）、青春后期、性成熟期、體成熟期、中老年期，成瘤過程漫長，與人類口腔癌的自然病程相似。4NQO誘導(dǎo)C57BL/6小鼠口腔黏膜成癌，經(jīng)歷了單純性上皮增生、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、原位癌、早期浸潤性癌的經(jīng)典病理過程，與人類口腔癌病理進(jìn)程相似。

本研究成功建立了舌癌動物模型，實驗12～16周及20～28周在黏膜病變病理上分別對應(yīng)著早期和中晚期，而且個體間的病變一致性良好，可作為研究舌黏膜癌變早期和中晚期階段的時間點。

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