棗GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

陳瑩瑩,趙智慧,卜嬌迪,趙 錦，*,劉孟軍，*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中國(guó)棗研究中心,河北保定 071001;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院,河北保定 071001)

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棗GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

陳瑩瑩1,趙智慧1,卜嬌迪2,趙 錦2，*,劉孟軍1，*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中國(guó)棗研究中心,河北保定 071001;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院,河北保定 071001)

GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-D-mannose pyrophosphorylase,GMP)是植物AsA生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶,至今未見該基因在棗中的相關(guān)報(bào)道。本研究根據(jù) GenBank 中登錄的蘋果、桃和草莓等植物GMP保守序列設(shè)計(jì)引物,采用同源克隆法,從“駿棗”果實(shí)中克隆出該基因并對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。該基因包含完整的開放閱讀框?yàn)?086bp,編碼361個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)蛋白分子量為39.588ku,理論pI值為7.12,命名為ZjGMP(登錄號(hào)KJ934995);序列分析表明,棗GMP與桃、葡萄、草莓、蘋果GMP的相似性分別為88%、87%、87%和87%。進(jìn)化樹分析表明,該基因與桃、蘋果和草莓等植物的GMP親緣關(guān)系較近。

棗,GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶,基因克隆,生物信息學(xué)分析

抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)又稱維生素C(VC),在生物體中具有重要的代謝功能和抗氧化作用。一方面,它是維持人體健康必不可少的物質(zhì)[1],缺乏AsA會(huì)導(dǎo)致壞血病;另一方面,在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)分裂以及激素合成等諸多方面發(fā)揮著重要作用[2],此外,在植物抗寒、抗旱及耐鹽堿等抗逆方面有非常重要的生理功能[3]。棗樹(ZiziphusjujubaMill.)是我國(guó)重要的藥食同源植物之一[4],棗果中富含高AsA而廣受人們關(guān)注,大部分棗品種果實(shí)中AsA含量高達(dá)400～600mg/100g,有一些品種甚至高達(dá)1000mg/100g。因此,研究棗中AsA的合成和調(diào)控機(jī)制,對(duì)揭示棗果積累高含量AsA有著重要意義。

高等植物中主要以L-半乳糖途徑合成AsA[5-8],如刺梨、蘋果、獼猴桃等。GMP是L-半乳糖途徑中的第一步關(guān)鍵酶,催化D-甘露糖-1-磷酸生成GDP-D-甘露糖。GDP-D-甘露糖是AsA合成的基本前提物質(zhì),同時(shí)又是細(xì)胞壁多糖合成和蛋白質(zhì)糖基化的原料。GMP基因已從擬南芥[9]、桃[10]、番茄[11]等植物中克隆得到,在棗中未見GMP基因的相關(guān)報(bào)道。鄒禮平[12]在研究番茄AsA生物合成與代謝相關(guān)基因克隆與調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn)GMP 基因在果實(shí)中的表達(dá)高于其他器官。Badejo等[13]研究金虎尾GMP基因的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn),GMP 基因在果實(shí)中的表達(dá)水平高于其他器官且在青熟果中表達(dá)量最高,隨著果實(shí)的成熟,其在 mRNA 水平上的表達(dá)也降低。因此,本研究擬以“駿棗”為材料,從中克隆GMP基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,以期通過生物技術(shù)的方法提高棗AsA的含量,這對(duì)于增加棗產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和增強(qiáng)棗樹本身抗逆性,都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料 取自山西省國(guó)家棗種質(zhì)資源圃,品種為“駿棗”,采樣時(shí)間為2013年6月,在田間采集新鮮果實(shí)后迅速放入冰盒,帶回實(shí)驗(yàn)室液氮速凍后存于-70℃冰箱備用。

感受態(tài)大腸桿菌DH5α、PMD-19T Vector 購(gòu)自寶生物工程有限公司產(chǎn)品；凝膠純化試劑盒(EZ-10 Spin柱式DNA膠回收試劑盒)、引物合成及測(cè)序 由上海生工生物工程有限公司完成；TransScript First-strand cDNA synthesis super Mix AT301 購(gòu)于全試金公司 其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

DYY-34型瓊脂糖水平電泳槽 北京六一儀器廠;TC-XP型基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技;高速冷凍離心機(jī) Sigma3K15型;PSH-3C型酸度計(jì);電子天平 賽多麗斯精度1/1000g;SZ-自動(dòng)雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠;凝膠成像系統(tǒng)、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、電泳槽、濕轉(zhuǎn)儀 美國(guó)Bio-Rad公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司,型號(hào)D1-15000AB。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GMP基因的cDNA克隆 棗果實(shí)總RNA的提取參照改良的CTAB法[14],參考TransScript First-strand cDNA synthesis super Mix AT301(TransGen Biotech,China)使用說明合成cDNA 第1鏈。以合成的cDNA第1鏈為模板,根據(jù)已報(bào)道的蘋果(AAV49507.1)、桃(BAH03301)、草莓(XM_004307527.1)等GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物,GMP-F:5′-ATGAA GGCACTTATTCTYGTYGGDG-3′;GMP-R:5′-TYACATDACAATYTCYGGCTTCAAA-3′,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,退火溫度55℃ 1min,72℃延伸1min,40個(gè)循環(huán);72℃終延伸10min。

將克隆獲得的產(chǎn)物切膠回收,與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,在含有Ampicillin抗性的固體LB培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng),挑取單菌落,在Ampicillin抗性的液體LB培養(yǎng)基上37℃搖菌6h,經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后送公司測(cè)序。

1.2.2 棗L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶基因cDNA序列的生物信息學(xué)分析 將所測(cè)定的序列應(yīng)用DNAMAN進(jìn)行比對(duì)和拼接,并將其翻譯成蛋白質(zhì);用ProtParam計(jì)算蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和理論等電點(diǎn);通過ExPASy Proteomics Server系統(tǒng)中的軟件在線預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu);用NCBI網(wǎng)站的CDD(Conserved Domain Database)進(jìn)行氨基酸序列結(jié)構(gòu)域分析;利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行Blast 序列相似性分析,查找同源的蛋白質(zhì)序列,用MEGA 5繪制同源進(jìn)化樹。用Signal P3.0 Server(http://www.cbs.dtu. dk/services/Signal P)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列中信號(hào)肽的預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗果實(shí)總RNA的提取

本實(shí)驗(yàn)利用改良CTAB法提取獲得的駿棗果實(shí)RNA,總RNA用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見圖1。由圖1可以看出,獲得的RNA其28S rRNA和18S rRNA兩條帶清晰完整,基本無拖尾,說明提取的RNA完整、無降解。同時(shí),經(jīng)檢測(cè),不同樣品的核酸濃度均達(dá)到150ng/μL以上,且OD260/OD280介于1.9～2.0之間,說明RNA的含量和純度可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 提取獲得的 RNA 電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of extracted RNA

注:M為DL 2000 marker分子量標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 棗GMP基因完整開放閱讀框的獲得

利用本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的GMP-F和GMP-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,先利用梯度PCR技術(shù)[15]篩選出最佳退火溫度為55℃,隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得了1086bp左右的片段,編碼361個(gè)氨基酸,該產(chǎn)物與pMD-19T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序,得到1086bp的完整編碼區(qū)序列(圖2)。在 NCBI 進(jìn)行 BLAST 比對(duì),發(fā)現(xiàn)該序列和桃GMP基因(AB457581.1)相似性達(dá)到88%,和蘋果(GQ149071.1)、草莓(XM_004307527.1)GMP基因相似性達(dá)到87%,初步證明本研究獲得的序列為棗的GMP基因序列,NCBI登錄號(hào)為KJ934995,命名為ZjGMP。

圖2 棗GMP基因編碼區(qū)擴(kuò)增結(jié)果和推測(cè)的氨基酸序列Fig.2 Electrophoresis result of CDS and deduced amino acid sequence of ZjGMP

注:1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M為DL 2000 marker分子量標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 棗ZjGMP蛋白生物信息學(xué)分析

在線(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)ZjGMP所編碼的氨基酸序列蛋白分子質(zhì)量為39.588ku,理論等電點(diǎn)為7.12;用GOR IV做了二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(圖3),表明ZjGMP含有20.5% α-螺旋結(jié)構(gòu),27.15%擴(kuò)展鏈,52.35%無規(guī)則卷曲,它們交替散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。利用Blastp搜索棗GMP氨基酸序列保守功能區(qū),發(fā)現(xiàn)該基因含有醛酮還原酶的保守結(jié)構(gòu)域及LbetaH 家族保守區(qū)(圖4),這些保守區(qū)在細(xì)胞壁多糖合成、蛋白質(zhì)糖基化及蛋白轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等過程中具有重要作用[16-18]。將已獲得的棗核苷酸序列與GenBank中已登錄的其它高等植物GMP核苷酸序列相比對(duì),發(fā)現(xiàn)棗GMP與桃、葡萄、草莓、蘋果GMP的相似性分別為88%、87%、87%和87%。用軟件DNAMAN對(duì)棗ZjGMP推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物的GMP氨基酸序列進(jìn)行保守序列比對(duì),結(jié)果見圖5。圖5結(jié)果顯示,本研究獲得的ZjGMP蛋白序列與其他植物的具有很高的同源性,進(jìn)一步表明該序列為棗的GMP基因序列。同時(shí),利用棗和蘋果、草莓、桃等植物GMP序列,構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6),從該進(jìn)化樹可以看出,棗ZjGMP蛋白與桃、蘋果和草莓的親緣關(guān)系較近。另外,經(jīng)信號(hào)肽掃描(SignalP 3.0)結(jié)果表明,該基因不存在信號(hào)肽序列,編碼的產(chǎn)物為非分泌型蛋白。

圖3 ZjGMP基因氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Predicted second structure of amino acid of ZjGMP gene

注：h、e、c分別表示α-螺旋、擴(kuò)展鏈 和無規(guī)則卷曲氨基酸殘基。

圖4 ZjGMP蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.4 Conserved domains of ZjGMP

圖5 ZjGMP和其他植物GMP基因蛋白保守結(jié)構(gòu)比對(duì)Fig.5 Homology comparison of amino acid sequences alignment of ZjGMP with other plants

注:獼猴桃(Actinidia delicious)野茶樹(Camellia sinensis) 溫州蜜柑(Citrus unshiu)蘋果(Malus domestica) 煙草(Nicotiana tabacum)碧桃(Prunus persica) 棗(Ziziphus jujuba)。

圖6 棗ZjGMP基因與其他植物 GMP基因之間的分子進(jìn)化樹Fig.6 Phylogentic tree of ZjGMP and GMP genes from other plants

3 結(jié)論

在高等植物中已經(jīng)證實(shí)L-半乳糖途徑是抗壞血酸的主要合成途徑,而GMP基因是該途徑中第一個(gè)關(guān)鍵酶,目前已在桃、番茄和蘋果等植物中克隆得到了GMP基因,并進(jìn)行了較深入的研究,本研究采用同源克隆法首次獲得了棗GMP基因,該基因cDNA序列含有1086bp的完整開放閱讀框,編碼361個(gè)氨基酸殘基,與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的桃、蘋果及草莓等植物的GMP基因具有很高的同源性,對(duì)該序列保守區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),ZjGMP基因存在一個(gè)左手平行的β-螺旋結(jié)構(gòu)即LbetaH 家族保守區(qū),該保守區(qū)包括三個(gè)不完全串聯(lián)重復(fù)的六肽重復(fù)模型,說明其具有酰基轉(zhuǎn)移酶的活性,具有這種結(jié)構(gòu)的亞族也表現(xiàn)出離子轉(zhuǎn)運(yùn)或者翻譯起始的活性,這與GMP基因的催化產(chǎn)物GDP-D-甘露糖作為細(xì)胞壁合成和蛋白質(zhì)糖基化的原料相符合。GMP基因不但對(duì)抗壞血酸合成起著關(guān)鍵作用,而且對(duì)植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育也都有重要的作用。利用MEGA 5對(duì)其核苷酸序列與其他8個(gè)物種的GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶進(jìn)行了比對(duì),構(gòu)建了進(jìn)化樹,分析了與其他8個(gè)物種之間的親緣關(guān)系。

本研究首次得到了棗抗壞血酸GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因的完整開放閱讀框,對(duì)其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征分類進(jìn)行了研究,為進(jìn)一步基因功能及分子育種研究奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and bioinformatic analysis ofGDP-D-mannose pyrophosphorylase gene fromZiziphusjujuba

CHEN Ying-ying1,ZHAO Zhi-hui1,BU Jiao-di2,ZHAO Jin2，*,LIU Meng-jun1，*

(1.Research Center of Chinese Jujube,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China;2.College of Life Science,Agricultural University of Hebei,Baoding,071001,China)

GDP-D-mannose pyrophosphorylase is an enzyme ininitial committed step of AsA biosynthesis,which has not been reported in Chinese jujube. In this paper,an 1086bp open reading frame cDNA encoding GMP was cloned from ‘junzao’ by homologous gene cloning method on the basis of the homologous genes ofMalusdomestica,PrunuspersicaandFragariavesca,etc. in GenBank. The sequence was namedZjGMP(accession number KJ934995)and encoded 361 amino acids,with molecular weight 39.588ku and theoretical isoelectric point 7.12. Similarity analysis showed that the protein had highly similar to theZjGMPofPrunuspersica,Vitisvinifera,FragariavescaandMalusdomesticawith similar of 88%,87%,87% and 87% respectively;phylogenic analysis showed that GMP from jujube had a closer relationship with that fromPrunuspersica,MalusdomesticaandFragariavesca.

Ziziphusjujuba;GDP-D-mannose pyrophosphorylase;cloning;bioinformatic analysis

2014-06-12

陳瑩瑩(1987- )，女，在讀碩士生，研究方向:果樹活性物質(zhì)與功能性食品。

*通訊作者:劉孟軍(1966-)，男，博士，研究方向:干果種質(zhì)資源與分子輔助育種。 趙錦(1977-)，女，博士，研究方向:植物種質(zhì)資源利用。

國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(2013BAD14B03)；河北省科技支撐計(jì)劃(11230606D-6)；河北省青年拔尖人才計(jì)劃。

TS201.3

A

1002-0306(2015)05-0140-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.021