絞股藍(lán)茶總皂苷的純化及其抗氧化活性研究

郭建軍,雷 曉,任道遠(yuǎn),楊紅燕,楊興斌

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119)

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絞股藍(lán)茶總皂苷的純化及其抗氧化活性研究

郭建軍,雷 曉,任道遠(yuǎn),楊紅燕,楊興斌*

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119)

研究了絞股藍(lán)茶總皂苷的提取、純化及其抗氧化活性。采用熱水浸提法提取,D101大孔吸附樹脂純化,并通過DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子的清除率對純化的總皂苷進(jìn)行抗氧化活性研究。結(jié)果表明:粗提取的絞股藍(lán)茶總皂苷含量為3.91%。D101大孔吸附樹脂對提取的絞股藍(lán)茶總皂苷進(jìn)行純化后,總皂苷的純度從26.2%提高到了83%。純化后的絞股藍(lán)茶總皂苷在濃度為4、3、3mg/mL時(shí)對DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、超氧陰離子清除率分別可達(dá)到92%、82%、73%。說明D101大孔吸附樹脂對絞股藍(lán)茶總皂苷有很好的純化效果,且純化后的總皂苷有很好的抗氧化活性。

絞股藍(lán)茶,總皂苷,提取純化,抗氧化活性

絞股藍(lán),又名“七葉膽”,屬于葫蘆科的一種多年生藤本植物草,是一種知名的藥食兩用的植物,在中國分布很廣,特別是秦嶺和長江以南地區(qū)。絞股藍(lán)已經(jīng)臨床運(yùn)用于抑制膽固醇水平、調(diào)節(jié)血壓、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、治療慢性支氣管炎和胃炎、減少炎癥等[1],且研究已經(jīng)表明它毒害作用甚微[2]。制成保健茶飲用,味道純正,極具保健價(jià)值,長期飲用無毒副作用,被譽(yù)為“南方人參”[3],定期飲用絞股藍(lán)茶可有益于身心健康和減少許多疾病的嚴(yán)重程度[4]。臨床觀察和隨訪發(fā)現(xiàn)每天用絞股藍(lán)6～10g泡茶,堅(jiān)持服用對預(yù)防和治療高血脂誘發(fā)心腦血管疾病的發(fā)生可起到很好的抑制和緩解作用[5]。

絞股藍(lán)皂苷(Gypenosides)是絞股藍(lán)全草的有效成分,具有顯著降血脂、降血糖、平衡血壓、抗癌、抗疲勞、抗缺氧、抗衰老、促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝、提高免疫功能、鎮(zhèn)痛、催眠的作用,對大腦中樞有良好的鎮(zhèn)靜、興奮雙向調(diào)節(jié)作用及白嫩肌膚等功能[6-7]。

絞股藍(lán)茶是將收割后的絞股藍(lán)莖或葉,經(jīng)過凈制、蒸制、炒制、揉制、烘制、包裝等工藝加工而成的飲用茶。

目前,絞股藍(lán)活性成分多糖、皂苷、黃酮等的提取、純化及其抗氧化活性的研究都有報(bào)道[8-10],以及一些絞股藍(lán)茶的功效也有新聞報(bào)道[11-12],但對于已經(jīng)成功投入市場的絞股藍(lán)茶的活性成分的研究尚未見報(bào)道?；谝陨显?我們選取陜西平利縣絞股藍(lán)龍須茶作為研究對象,從提取純化方面對絞股藍(lán)茶總皂苷進(jìn)行研究,并對純化后的總皂苷進(jìn)行了抗氧化評價(jià),以便為絞股藍(lán)茶的開發(fā)和應(yīng)用提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

絞股藍(lán)茶 平利縣興強(qiáng)富硒茶葉有限公司;鹽酸、冰乙酸、高氯酸、無水乙醚、正丁醇、香草醛、無水乙醇、過氧化氫、甲醇、氫氧化鈉、抗壞血酸、硫酸亞鐵 均為分析純;氯仿、水楊酸為化學(xué)純;DPPH、NBT、NADH、PMS Sigma公司;D101樹脂 天津波鴻樹脂科技有限公司;人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所。

LD4-2低速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;冷凍干燥設(shè)備 EZ-DRY杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司;HH-6B數(shù)顯恒溫水浴鍋 杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司;AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;752-N紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;大孔樹脂柱 沈陽天美達(dá)科學(xué)儀器有限公司;FZ102微型植物粉碎機(jī) 黃驊市中興有限責(zé)任公司;超純水儀 MILLI-Q MILLIPORE公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海比朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確稱取干燥好的人參皂苷Rb110mg,倒入10mL的容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,然后分別取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)液置于具塞的試管中,于60℃水浴中揮去溶劑,加5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL(現(xiàn)用現(xiàn)配)、高氯酸0.8mL,混勻密置,在60℃水浴中加熱15min,冰水浴冷卻后加冰醋酸5mL,相應(yīng)試劑為空白,在550nm下測吸光值[6]。以人參皂苷Rb1的量x(mg/mL)對吸光值進(jìn)行回歸,求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.2 絞股藍(lán)茶總皂苷的含量測定 絞股藍(lán)茶總皂苷的含量測定采用香草醛-高氯酸比色法,吸取100μL的樣液于試管里,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法測吸光值,然后將吸光值帶進(jìn)回歸方程,計(jì)算出樣液的皂苷含量[13]。然后用下面公式計(jì)算總樣液的皂苷含量(M)。

式中:C為100μL樣液中皂苷含量(mg),V1為樣液總體積(mL),V2為取樣體積,100μL。

1.2.3 絞股藍(lán)茶總皂苷最佳提取工藝的正交設(shè)計(jì) 準(zhǔn)確稱量9份50g的絞股藍(lán)茶粉末于燒瓶中,分別用不同的料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)作為實(shí)驗(yàn)因素,每個(gè)因素取3個(gè)水平[14],因素水平見表1。取樣品,按照正交設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以絞股藍(lán)總皂苷的得率為考察指標(biāo),進(jìn)行提取工藝的優(yōu)選。

式中:M1為提取液中的皂苷重量/mg,M為稱取的絞股藍(lán)茶重量/mg。

表1 因素與水平表Table1 The table of factor and level

1.2.4 D101大孔吸附樹脂的處理 稱取200g D101固體粉末置于4%的NaOH溶液中,浸泡2h后用無離子水洗至中性,然后加入4%的HCl溶液,浸泡2h后用無離子水洗至中性,裝柱,用無離子水浸泡,待用[15]。

1.2.5 絞股藍(lán)茶總皂苷吸附量、吸附率的測量 將粗提取的樣品配成濃度為4mg/mL。上柱靜態(tài)吸附2h后,然后用濃度為30%、50%、70%、90%的乙醇洗脫,收集各個(gè)梯度的洗脫液,每個(gè)濃度收集5管,每管20mL?？傇碥瘴搅?Q)、吸附率(D)及洗脫率(W)按下列公式計(jì)算[13]。

Q=M1-M2

式中:M1為初始液總皂苷含量/mg,M2為水洗脫液總皂苷含量/mg,M3洗脫液中總皂苷含量/mg。

1.2.6DPPH自由基清除能力測定 參考文獻(xiàn)[16],取不同濃度的皂苷溶液(0.1、0.5、1、2、4mg/mL)各1mL和2mL95%乙醇混合,分別加入1mmol/LDPPH溶液2mL。混合后用力搖晃,在黑暗條件下放置30min,然后在517nm下測各吸光值。用VC(0.05、0.5、1、2、4mg/mL)代替皂苷做陽性對照,用95%乙醇代替DPPH做陰性對照,用95%乙醇代替皂苷做空白對照。

式中:A0表示空白對照組吸光值;Ai表示樣品組吸光值;Aj表示陰性對照組吸光值。

1.2.7 羥基自由基的清除能力測定 參考文獻(xiàn)[16],取不同濃度的皂苷溶液(0.1、0.5、1、2、3mg/mL)1mL和1mL6mmol/L的硫酸亞鐵混合,再加入2mL6mmol/L的雙氧水,反應(yīng)10min,之后再加入2mL6mmol/L的水楊酸,充分混勻,反應(yīng)30min。最后在510nm下測各吸光值。用VC(0.1、0.25、0.5、1、3mg/mL)代替皂苷做陽性對照,用蒸餾水代替雙氧水做陰性對照,用95%乙醇代替皂苷做空白對照。

式中:A0表示空白對照組吸光值;Ai表示樣品組吸光值;Aj表示陰性對照組吸光值。

1.2.8 超氧陰離子的清除能力測定 參考文獻(xiàn)[17]并做了稍微的修改,取不同濃度的皂苷溶液(0.1、0.5、1、2、3mg/mL)各1mL,依次加入1mL 0.078mol/L NBT溶液,1mL 0.468mol/L NADH溶液,0.4mL 0.06mol/L PMS溶液?；旌暇鶆?放置5min,最后在560 nm下測各吸光值。用VC(0.1、0.25、0.5、1、3mg/mL)代替皂苷做陽性對照,用蒸餾水代替PMS做陰性對照,用95%乙醇代替皂苷做空白對照。

式中:A0表示空白對照組吸光值;Ai表示樣品組吸光值;Aj表示陰性對照組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)都均進(jìn)行三次重復(fù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Microsoft Excel和DPS 7.05軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 絞股藍(lán)茶總皂苷最佳提取工藝的確定

按1.2.3方法,選取料液比、提取時(shí)間、提取溫度為三個(gè)因素,每個(gè)因素選取三個(gè)水平,選用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2,實(shí)驗(yàn)方差分析見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 2 The table of orthogonal experiment result

表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

注:F0.01(2,2)=99.00,F0.05(2,2)=19.00。

由表2結(jié)果可知,A、B、C的極差分別為0.35、0.69、0.06。由此可知,因素對實(shí)驗(yàn)的影響程度為:B>A>C,即提取溫度>料液比>提取時(shí)間。表3結(jié)果可知,只有因素B的F值大于F0.05(2,2),即因素B對總皂苷得率影響顯著,因此,在提取過程中,對溫度的選擇最為重要。根據(jù)上述條件,確定最佳的提取條件為A3B3C2,即料液比為1∶35,提取時(shí)間為90min,提取溫度為85℃。

2.2 絞股藍(lán)茶總皂苷的含量

按1.2.1的方法制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=7.8377x-0.0018(R2=0.9977)。分別稱取純化前后的絞股藍(lán)茶粉末20mg,配成一定濃度的溶液,按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和1.2.2的方法測得純化前后絞股藍(lán)茶總皂苷含量為5.24、16.6mg,結(jié)果見表4。

表4 絞股藍(lán)茶總皂苷的含量和純度Table 4 The quality and purityof gynostemma tea total saponins

2.3 絞股藍(lán)茶總皂苷的純化

絞股藍(lán)茶總皂苷經(jīng)D101大孔吸附樹脂純化,吸附前樣品的皂苷含量為104.71mg,吸附后樣品的皂苷含量為31.02mg,通過1.2.5中公式計(jì)算出吸附量、吸附率分別為73.69mg、70.38%,說明D101型非極性樹脂對皂苷有很好的吸附作用。按1.2.2方法計(jì)算出的每管皂苷洗脫量,以洗脫液收集管號為橫坐標(biāo),每管總皂苷含量為縱坐標(biāo)繪制柱形圖,結(jié)果見圖1。

圖1 絞股藍(lán)茶總皂苷洗脫柱形圖Fig.1 Gynostemma tea total saponins elution columu diagram

圖1中,1～5號管為濃度為30%的乙醇洗脫液,6～10號管為濃度為50%的乙醇洗脫液,11～15號管為濃度為70%的乙醇洗脫液,16～20號管為濃度為90%的乙醇洗脫液。

由圖1可知,70%的乙醇對皂苷的洗脫量最大,50%的乙醇對皂苷的洗脫量次之,因此確定最佳的洗脫濃度應(yīng)為50%～70%的乙醇。表5可知50%和70%的乙醇對皂苷的洗脫量占到總洗脫量的33.36%,且70%乙醇洗脫的占到47.79%,因此本實(shí)驗(yàn)選取濃度為70%的乙醇進(jìn)行洗脫,洗脫后的皂苷的純度可以達(dá)到83%,這與絞股藍(lán)的純化結(jié)果基本相一致[15],說明D101大孔吸附樹脂對絞股藍(lán)茶皂苷有很好的純化效果。

2.4 DPPH自由基清除率

按1.2.6方法,以皂苷、VC的濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),DPPH自由基清除率結(jié)果見圖2。

表5 不同乙醇濃度下皂苷的洗脫量表Table 5 The table of saponins underdifferent concentration ethanol elution

圖2 總皂苷清除DPPH·的能力Fig.2 The scavenging capacity to DPPH· of total saponins

從圖2中可以看出,VC在濃度很低的情況下對DPPH·有很強(qiáng)的清除力,VC濃度為0.05mg/mL時(shí),清除率就可以達(dá)到91%,隨濃度的增加,濃度為1mg/mL時(shí)清除率可以達(dá)到97%,之后清除率增長趨于平緩。皂苷的清除率在濃度2mg/mL前增長很快,在濃度2mg/mL后清除率增長平緩,濃度為4mg/mL時(shí)清除率可以達(dá)到92%。純化后,絞股藍(lán)茶中的多酚,黃酮類等天然抗氧化化合物被分離,但純化的皂苷依然有很高的清除DPPH·的能力,這與以往的研究基本一致[10]。

2.5 羥自由基清除率

按1.2.7方法,以皂苷、VC的濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),計(jì)算的羥自由基清除率結(jié)果見圖3。

圖3 總皂苷清除·OH的能力Fig.3 The scavenging capacity to ·OH of total saponins

從圖3中可以看出,VC在濃度很低的情況下對羥基自由基有很強(qiáng)的清除力,在濃度1mg/mL清除率就達(dá)到95%,隨濃度的增加,清除率增長趨于平緩。皂苷的清除率在濃度2mg/mL前增長很快,在濃度2mg/mL后清除率增長平緩,濃度為3mg/mL時(shí)清除率可以達(dá)到82%。這與絞股藍(lán)的粗提取物相比,清除率有所降低[18],這可能與純化過程中多酚,黃酮類化合物的分離有關(guān),這些物質(zhì)也是很好的抗氧化劑,對羥基自由基也有很高的清除率。

2.6 超氧陰離子的清除率

圖4 總皂苷清除·的能力Fig.4 The scavenging capacity to · of total saponins

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過正交法,確定了絞股藍(lán)茶總皂苷的最佳提取工藝為料液比為1∶35,提取時(shí)間為90min,提取溫度為85℃。在這一條件下,總皂苷得率可以達(dá)到3.91%,表明了該工藝對總皂苷有很好的提取效果。

利用D101大孔吸附樹脂對提取的絞股藍(lán)茶粗皂苷進(jìn)行純化時(shí),D101大孔吸附對皂苷的吸附率可以達(dá)到70.38%,D101大孔吸附樹脂處理后的總皂苷的純度從26.2%提高到83%,說明D101大孔吸附樹脂對皂苷有很好的純化效果。

利用DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的清除率對絞股藍(lán)茶總皂苷進(jìn)行抗氧化性評價(jià),結(jié)果表明皂苷對DPPH自由基的清除率在濃度為4mg/mL可以達(dá)到92%;皂苷對羥基自由基的清除率在濃度為3mg/mL可以達(dá)到82%;皂苷對超氧陰離子的清除率在濃度為3mg/mL可以達(dá)到73%,這些數(shù)據(jù)充分說明絞股藍(lán)茶總皂苷有很好的抗氧化能力。

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Study on purification and antioxidant activityof total saponins of gynostemma tea

GUO Jian-jun,LEI Xiao,REN Dao-yuan,YANG Hong-yan,YANG Xing-bin*

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China)

Extraction,purification and antioxidant activity of the total saponins from gynostemma tea was investigated in the study. The total saponins was obtained with hot water extraction and then purified by D101 macroporous adsorption resin.Invitroantioxidant activities of the purfied fraction were characterized by DPPH free radical,hydroxyl radical and superoxideanion systems. The results showed that the crude extract of total saponins in gynostemma tea was 3.91%. After the D101 macroporous adsorption resin purification,the purity of total saponins increased from 26.2% to 83%. Besides,the sacvenging rate of the purified fraction to DPPH free radical,hydroxyl radical and superoxideanion were 92%,82%,73% at 4,3,3mg/mL,respectively. The purification effect of total saponins in gynostemma tea by D101 macroporous adsorption resin was proved to be very well,and the purified total saponins was also proved to have a good antioxidant activity.

gynostemma tea;total saponins;extraction and purification;antioxidant

2014-05-15

郭建軍(1988-),男,碩士研究生,主要從事食品營養(yǎng)與功能的研究。

*通訊作者:楊興斌(1969-),男,博士,教授,主要從事食品生物技術(shù)、食品分子營養(yǎng)與功能性食品研究。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C31171678)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)05-0099-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.012