石吊蘭總多酚體外抗氧化活性研究

茍?bào)w忠，唐文華，任永權(quán)，孫大方，許西華

(1.凱里學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院,貴州凱里 556011;2.凱里學(xué)院富硒中草藥研究中心,貴州凱里 556011;3.凱里學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,貴州凱里 556011;4.環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院,貴州凱里 556011)

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石吊蘭總多酚體外抗氧化活性研究

茍?bào)w忠1,2,3，唐文華1,3，任永權(quán)4，孫大方1，許西華1

(1.凱里學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院,貴州凱里 556011;2.凱里學(xué)院富硒中草藥研究中心,貴州凱里 556011;3.凱里學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,貴州凱里 556011;4.環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院,貴州凱里 556011)

研究石吊蘭總多酚的體外抗氧化活性。采用單因素實(shí)驗(yàn)研究提取時(shí)間、超聲波功率、提取溫度、乙醇濃度、提取次數(shù)和料液比對(duì)總多酚提取率的影響。用還原能力、·OH 清除率、DPPH·清除率來(lái)考察石吊蘭總多酚的體外抗氧化活性。結(jié)果表明,超聲提取石吊蘭總多酚的最佳工藝條件為:提取時(shí)間32min,超聲波功率為100%,提取溫度為25℃,乙醇濃度為80%,提取次數(shù)為3次,液料比為20∶1,此時(shí)石吊蘭總多酚得率為14.0mg GAE/g。此外,石吊蘭總多酚的還原能力、對(duì)·OH以及DPPH· 的清除均高于VC。石吊蘭總多酚是天然的抗氧化活性劑和自由基清除劑。

石吊蘭,總多酚,抗氧化活性

石吊蘭為苦苣苔科(Gesneriacee)吊石苣苔屬植物吊石苣苔(Lveicnotus pauciflorus Maximl)的全草[1],又名石豇豆、石澤蘭、巖豇豆等,具有清肺止咳、涼血止血、祛濕化滯、通絡(luò)止痛之功效。石吊蘭主要分布于貴州、云南、四川、江蘇、廣西等地。前人已對(duì)石吊蘭進(jìn)行了一系列研究,并得出了以下結(jié)論:石吊蘭醇提液對(duì)S180 實(shí)體瘤有一定的抑瘤作用,其抑瘤率為42.1%[2];石吊蘭中的石吊蘭素是治療結(jié)核病的有效成分[3];首次從石吊蘭全草中分離出新的菖蒲烷類(lèi)倍半萜類(lèi)化合物3,10-dihydroxyacoronene[4];石吊蘭中含有生物堿、黃酮類(lèi)化合物、石吊蘭素和B-谷甾醇等化合物[5]。

總多酚是多羥基酚類(lèi)化合物的總稱(chēng),具有抗癌、抗病毒、抗氧化等生物活性[6-9]?？寡趸允侵参锟偠喾拥囊粋€(gè)重要性質(zhì),其抗氧化活性能力與多酚類(lèi)物質(zhì)的含量及種類(lèi)有關(guān)[8]?？偠喾油ㄟ^(guò)提供質(zhì)子,消除自由基,自身形成穩(wěn)定的共振結(jié)構(gòu)而阻斷氧化產(chǎn)生抗氧化作用,是醫(yī)藥、食品、化妝品中很有前景的一類(lèi)天然抗氧化劑[9]。目前,石吊蘭總多酚抗氧化活性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本文采用還原能力、羥基自由基清除率和DPPH自由基清除率來(lái)考查石吊蘭總多酚的抗氧化活性,從而為石吊蘭的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石吊蘭于2013年10月采自凱里市雷公山,經(jīng)凱里學(xué)院植物學(xué)博士鑒定為苦苣苔科(Gesneriacee)吊石苣苔屬植物吊石苣苔(Lveicnotus pauciflorus Maxim1)的全草。

三氯乙酸、沒(méi)食子酸、1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)、Folin&ciocalteu’s 酚試劑為aladdin試劑。其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì) UV-2550,島津;植物粉碎機(jī) 北京科偉永興儀器有限公司;水浴振蕩器 SHA-C型,鞏義予華儀器有限公司;超聲波 WH-300,濟(jì)寧萬(wàn)和超聲電子設(shè)備有限公司;低速離心機(jī)TD5M,長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;電子天平 上海衡平儀器儀表廠。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品處理 石吊蘭樣品于80 ℃烘箱中干燥,再用植物粉碎機(jī)粉碎并過(guò)80目篩,待用。

1.3.2 提取時(shí)間選擇 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g石吊蘭粉末樣品于5個(gè)50mL離心管中,在料液比為1∶20、乙醇濃度為80%、提取次數(shù)為2次、超聲波功率為100%和提取溫度為30℃的條件下,分別超聲提取4、8、16、32、64min,離心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法測(cè)定其總多酚的含量。

1.3.3 超聲波功率的選擇 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g石吊蘭粉末樣品于5個(gè)50mL離心管中,在料液比為1∶20、乙醇濃度為80%、提取次數(shù)為2次、提取溫度為30℃和提取時(shí)間為32min的條件下,分別以40%、50%、60%、80%、100%的超聲波功率提取總多酚,離心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法測(cè)定其總多酚的含量。

1.3.4 提取溫度的選擇 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g石吊蘭粉末樣品于5個(gè)50mL離心管中,并在料液比為1∶20、乙醇濃度為80%、提取次數(shù)為2次、超聲波功率為100%、提取時(shí)間為32min的條件下,分別以20、40、60、80、100℃水溫提取總多酚,離心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法測(cè)定其總多酚的含量。

1.3.5 乙醇濃度的選擇 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g石吊蘭粉末樣品于8個(gè)50mL離心管中,并在料液比為1∶20、提取次數(shù)為2次、超聲波功率為100%、提取溫度為30℃和提取時(shí)間為32min的條件下,分別用 30%、40%、50、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液提取總多酚,離心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法測(cè)定其總多酚的含量。

1.3.6 提取次數(shù)對(duì)石吊蘭總多酚含量的影響 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g石吊蘭粉末樣品于5個(gè)50mL離心管中,并在料液比為1∶20、超聲波功率為100%、乙醇濃度為80%、提取溫度為30℃和提取時(shí)間為32min的條件下,分1、2、3、4、5次提取總多酚,離心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法測(cè)定其總多酚的含量。

1.3.7 料液比的選擇 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g石吊蘭粉末樣品于5個(gè)50mL離心管中,并在超聲波功率為100%、乙醇濃度為80%、提取溫度為30℃、提取次數(shù)為3次和提取時(shí)間為32min的條件下,分別用料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50提取總多酚,離心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法測(cè)定其總多酚的含量。

1.3.8 總多酚測(cè)定 總多酚含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]并稍作修改。其簡(jiǎn)要流程為:準(zhǔn)確稱(chēng)取0.125 g沒(méi)食子酸用超純水定容至1000mL。分別吸取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5mL于6個(gè)25mL比色管中,先加超純水至10mL,搖勻,再加入Folin-Ciocalteu(FC)酚試劑1.0mL,混勻,然后加入6.0mL 10%Na2C03溶液,并用超純水定溶至刻度,搖勻。然后在暗室中放置2h,并于760nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。以沒(méi)食子酸濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),其回歸方程為:A=0.0838C+0.0067(r=0.9999)。取石吊蘭提取液0.2mL于25mL比色管中,按上述步驟測(cè)定其吸光度,再根據(jù)回歸方程計(jì)算石吊蘭提取液總多酚的濃度,并以此計(jì)算其多酚含量,以每克樣品中沒(méi)食子酸當(dāng)量表示(mg GAE/g)。

1.3.9 醇提物還原能力測(cè)定 還原能力的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[11],其簡(jiǎn)要流程為:取1mL不同濃度的提取液,并依次加入2.5mL的 pH6.6 的磷酸鹽緩沖液和1%(m/v)鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液,搖勻并置于50℃水浴振蕩器中振蕩20min。然后加入2.5mL 10%(m/v)三氯乙酸溶液,搖勻并取混液 2.5mL,再加入2.5mL 超純水以及0.1%(m/v)氯化鐵溶液,搖勻并靜置10min,在 700nm處測(cè)定吸光度(As),以超純水代替提取液作為空白并測(cè)定其吸光度 Ac。則還原能力可以用ΔA來(lái)表示(ΔA=As-Ac),其值越大,提取液還原能力越強(qiáng)。

1.3.10 ·OH清除率的測(cè)定 ·OH清除率的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[11],其簡(jiǎn)要流程為:在25 mL比色管中依次加入4mL pH7.4磷酸鈉緩沖液以及1.5mL 5mmol/L鄰二氮菲溶液、1mL 7.5mmol/L FeSO4溶液、1.5mL雙蒸水,搖勻,再加入1mL不同濃度的提取液,立即搖勻。然后加入1mL 1%(v/v)H2O2溶液,搖勻并置于37℃恒溫水浴中恒溫60min。最后,在536nm處測(cè)定其吸光度。根據(jù)下式計(jì)算樣品對(duì)·OH清除率:

·OH清除率(%)=[(A1-A2)/(A0-A2)]×100

其中:A1為加入提取液及H2O2時(shí)測(cè)得的吸光度;A2為加 H2O2而不加提取液時(shí)測(cè)得的吸光度;A0為不加提取液及 H2O2時(shí)測(cè)得的吸光度。

1.3.11 DPPH·清除率測(cè)定 DPPH·清除率的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[12],其簡(jiǎn)要流程為:在25mL比色管中依次加入2mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液和2mL不同濃度的提取液,搖勻,并在暗室中放置30min,以無(wú)水乙醇為參比液,在517nm下測(cè)定其吸光值A(chǔ)s,同時(shí)測(cè)定2mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液與2mL無(wú)水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)c。根據(jù)下式計(jì)算樣品溶液對(duì)DPPH·的清除率:

DPPH·清除率(%)=(1-As/Ac)×100

1.3.12 數(shù)據(jù)處理方法 文中數(shù)據(jù)和圖表分別采用Excel、coreldraw12軟件處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 石吊蘭不同極性試劑提取液清除DPPH·的能力

從圖1可見(jiàn),石吊蘭不同極性試劑提取液對(duì)DPPH·的清除能力存在明顯差異,其大小順序?yàn)?乙醇>正丁醇>乙酸乙酯>甲醇>水>石油醚。由此可知,乙醇提取液具有較高的清除DPPH·的能力。因此,以下實(shí)驗(yàn)均以乙醇提取液為考察對(duì)象。

2.2 石吊蘭總多酚提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)石吊蘭總多酚含量的影響 從圖2A可見(jiàn),隨著超聲時(shí)間的增加,其總多酚含量增加,當(dāng)超聲時(shí)間為32min時(shí),其總多酚含量達(dá)到最大值。

圖1 不同提取液對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.1 Effection of the different extraction solution on DPPH· scavenging rate

2.2.2 超聲波功率對(duì)石吊蘭總多酚含量的影響 從圖2B可見(jiàn),隨著超聲波功率的增加,其總多酚含量增加,當(dāng)超聲波功率為100%時(shí),其總多酚含量達(dá)到最大值。

2.2.3 提取溫度對(duì)石吊蘭總多酚含量的影響 從圖2C可見(jiàn),在20～80℃的水溫條件下,石吊蘭總多酚含量幾乎保持不變。分析認(rèn)為,提取水溫對(duì)石吊蘭總多酚的含量影響不顯著,只需在室溫(25℃)下提取即可。

2.2.4 乙醇濃度對(duì)石吊蘭總多酚含量的影響 從圖2D可見(jiàn),隨著乙醇濃度的增加,其總多酚含量增加,當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí),其總多酚含量達(dá)到最大值。

2.2.5 提取次數(shù)對(duì)石吊蘭總多酚含量的影響 從圖2E可見(jiàn),隨著乙醇濃度提取的增加,其總多酚含量增加,當(dāng)提取次數(shù)為3次時(shí),其總多酚含量達(dá)到最大值且開(kāi)始保持不變。

通過(guò)不斷地實(shí)踐與改革，得到了較好的結(jié)果?！杜R床血液學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)》的教學(xué)改革多次被領(lǐng)導(dǎo)提及，并受到了學(xué)生們的一致好評(píng)，同學(xué)們的綜合成績(jī)也有所上升。

2.2.6 料液比對(duì)石吊蘭總多酚含量的影響 從圖2F可見(jiàn),隨著料液比的增加,其總多酚含量有所增加,當(dāng)料液比達(dá)到1∶20時(shí),其總多酚含量達(dá)到最大值,并保持恒定值。

2.3 石吊蘭總多酚含量

取石吊蘭乙醇提取液,在波長(zhǎng)760nm處測(cè)定其吸光度,代入1.3.8的回歸方程計(jì)算其多酚含量為14.0mg GAE/g。

2.4 石吊蘭總多酚的還原能力

以VC為對(duì)照樣品,分別測(cè)定石吊蘭總多酚和VC的還原能力。經(jīng)相關(guān)分析表明,石吊蘭總多酚和VC與還原能力之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系(其相關(guān)系數(shù)分別為0.9774和0.9944)。分析認(rèn)為,石吊蘭中抗氧化活性成分可能是有總多酚含量決定的。國(guó)外學(xué)者研究也表明,含有高水平總多酚的植物表現(xiàn)出很好的體外抗氧化活性[13]。從圖3可見(jiàn),隨著濃度的的增加石吊蘭總多酚以及VC還原能力增加,且石吊蘭總多酚的還原能力略高于VC。研究表明,石吊蘭多酚具有較強(qiáng)的還原能力。

圖2 提取條件對(duì)石吊蘭總多酚含量的影響Fig.2 Effect of extraction conditions on content of total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl

圖3 不同濃度石吊蘭總多酚對(duì)還原能力的影響Fig.3 Effect of the different concentration on reducing power from Lveicnotus pauciflorus Maximl

2.5 石吊蘭總多酚清除·OH的能力

以VC為對(duì)照樣品,分別測(cè)定石吊蘭總多酚和VC清除·OH的能力。經(jīng)相關(guān)分析表明,石吊蘭總多酚與VC對(duì)·OH的清除率之間存在明顯正相關(guān)關(guān)系(其相關(guān)系數(shù)分別為0.9999和0.9241)。分析認(rèn)為,石吊蘭醇提物清除·OH的活性主要是由總多酚成分決定的。由圖4可見(jiàn),石吊蘭總多酚對(duì)·OH的清除能力高于VC,這表明石吊蘭總多酚具有較好的清除·OH的能力。

圖4 不同濃度石吊蘭總多酚對(duì) ·OH清除率的影響Fig.4 Effect of the different concentration on OH· scavenging rate from Lveicnotus pauciflorus Maximl

以石吊蘭總多酚和VC濃度(X)對(duì)·OH的清除率(Y)作回歸分析。石吊蘭總多酚對(duì)·OH的清除率的回歸方程為:Y=0.0865X+2.9626(r=0.9999)。VC對(duì)·OH的清除率的回歸方程為Y=0.0054X+2.787(r=0.9241)。分析結(jié)果表明,石吊蘭總多酚清除·OH的活性遠(yuǎn)大于VC。

2.6 石吊蘭總多酚清除DPPH·的能力

以VC為對(duì)照樣品,分別測(cè)定石吊蘭總多酚和VC清除DPPH·的能力。經(jīng)相關(guān)分析表明,石吊蘭總多酚對(duì)DPPH·和VC的清除率之間呈明顯正相關(guān)(其相關(guān)系數(shù)分別為0.9996和0.9989)。分析認(rèn)為,石吊蘭醇提物清除DPPH·的活性可能主要是由總多酚成分決定的。由圖5可見(jiàn),隨著石吊總蘭總多酚和VC濃度的增加,其清除DPPH·的活性增加。分析認(rèn)為,石吊蘭總多酚具有很好的清除DPPH·的能力。

圖5 不同濃度石吊蘭總多酚對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.5 Effect of the different concentration on DPPH· scavenging rate from Lveicnotus pauciflorus Maximl

以石吊蘭總多酚和VC濃度(X)對(duì)DPPH·的清除率(Y)作回歸分析。石吊蘭總多酚對(duì)DPPH·的清除率的回歸方程為:Y=3.0136X+0.8166(r=0.9989)。VC對(duì)DPPH·的清除率的回歸方程為Y=2.7698X+1.3694(r=0.9996)。分析結(jié)果表明,石吊蘭總多酚清除DPPH·的能力稍強(qiáng)于VC。

3 結(jié)論

研究表明,超聲提取石吊蘭總多酚的最佳工藝條件為:提取時(shí)間為32min,超聲波功率為100%,提取溫度為25℃,乙醇濃度為80%,提取次數(shù)為3次,液料比為20∶1,此時(shí)石吊蘭總多酚得率為14.0 mg GAE/g。此外,通過(guò)對(duì)石吊蘭總多酚的還原能力、DPPH·清除率、·OH清除率的分析結(jié)果表明,石吊蘭總多酚具有較強(qiáng)的還原能力,較高的·OH清除能力,以及較強(qiáng)的DPPH·清除能力。分析認(rèn)為,石吊蘭總多酚具有較強(qiáng)的體外還原活性,是天然的抗氧化活性劑。

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Study on antioxidant activityinvitroof total polyphenolfrom Lveicnotus pauciflorus Maximl

GOU Ti-zhong1,2,3，TANG Wen-hua1,3，REN Yong-quan4，SUN Da-fang1，XU Xi-hua1

(1.Institute of Chemistry & Materials Engineering,Kaili University,Kaili 556011,China;2.Research center of selenium-riched Chinese Herbs,Kaili University,Kaili 556011,China;3.Institute of Applied Chemistry,Kaili University,Kaili 556011,China;4.Institute of Environment and Life Science,Kaili University,Kaili 556011,China)

To study the antioxidant activityinvitroof total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl.The single factor was taken to study the effects of extraction time,ultrasonic power,extraction temperature,extraction times,and ethanol concentration liquid-material ratio on the extraction rate of total polyphenol.The antioxidant activityinvitroof total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl was evaluated by reducing power,hydroxyl and DPPH free radical scavenging effect.The results showed that the optimum conditions for extracting the polysaccharides assisted by ultrasonic wave were as follows:extraction time 32min,ultrasonic power 100%,extraction temperature 25℃,extraction times 3,and ethanol concentration liquid-material ratio 20∶1,and the extraction rate of total polyphenol was up to 14.0mg GAE/g.In addition,the reducing power of total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl was more than VC,and the scavenging ability of DPPH· and ·OH was also stronger than VC.Total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl is an effective and natural antioxidant and free radical scavenger.

Lveicnotus pauciflorus Maximl;total polyphenol;antioxidant activity

2014-06-12

茍?bào)w忠(1981-)，男，博士，副教授，從事天然藥物化學(xué)研究。

國(guó)家青年自然科學(xué)基金(41303016)；貴州省科技廳自然科學(xué)基金(黔科合J字[2011]2079號(hào))；凱里學(xué)院博士專(zhuān)項(xiàng)基金(BS201003)；貴州省高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目(黔教合KY字[2012]099號(hào))；貴州省教育廳“高層次人才引進(jìn)項(xiàng)目”(院科通[2012]7號(hào))；凱里學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目(Z1202)；貴州省特色重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(黔教高發(fā)[2011]208號(hào))；凱里學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(院通字[2010]86號(hào))；貴州省優(yōu)秀科技人才省長(zhǎng)基金項(xiàng)目(黔省專(zhuān)合字[2011]77號(hào))；凱里學(xué)院分析化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科(院通字[2014]157號(hào))。

TS201.2

A

1002-0306(2015)05-0073-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.006