薄層色譜法鑒定藍狐膽汁及其?；切苋パ跄懰釋λ穆然几螕p傷的保護作用

周 博，賈競波，李佳銘

薄層色譜法鑒定藍狐膽汁及其牛磺熊去氧膽酸對四氯化碳肝損傷的保護作用

周 博1，賈競波2，李佳銘3

目的 確定藍狐膽汁的藥理作用。方法 取30只昆明種小鼠，分為5組，每組6只。分別為：(1)空白組，非肝損傷處理，投喂蒸餾水，注射無傷害性的豆油；(2)模型組，肝損傷處理，不投喂任何藥物，完全為四氯化碳(CCL4)急性肝損傷個體；(3)陽性組，肝損傷處理，投喂護肝片，0.4 g/kg；(4)高劑量組，肝損傷處理，投喂高劑量藍狐膽汁粉，10 g/kg；(5)低劑量組，肝損傷處理，投喂低劑量的藍狐膽汁粉，5 g/kg。首先用TLC法研究藍狐膽汁成分中是否含有熊膽特有成分——牛磺熊去氧膽酸(UDCA)，其次研究其膽汁對小鼠CCL4肝損傷是否有保護作用。結果 對比藍狐膽汁與熊膽汁，兩者的相似度約50%， 兩者共四類物質中，有兩類相同，藍狐膽汁中含有UDCA成分。實驗動物的肝臟被CCL4損傷之后，血清中的AST、ALT濃度明顯增高，模型組與空白組對比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過藥理結果及病理切片，可以看到具有抑制CCL4，造成急性肝損傷小鼠AST、ALT濃度降低的作用。結論 藍狐膽汁對損傷的肝細胞有修復意義，對肝臟有明顯的保護作用。

藍狐膽汁；谷草轉氨酶；谷丙轉氨酶；四氯化碳肝損傷

藍狐，食肉目(carnivora)犬科(canidae)狐屬(vulpes)的珍貴毛皮動物，是人工繁育一個世紀后的北極狐(alopex lagopus)后代[1]。藍狐膽囊在民間具有特有的藥用價值，《四川中藥志》中提及其膽“風干研細，兌開水服，治心氣痛”[2]。由于考慮藍狐與熊類親緣關系近，同為食肉目，其食性相似，投喂飼料的種類相似，因此本研究首先利用薄層色譜法(TLC)，研究藍狐膽汁成分中是否含有熊膽特有成分——?；切苋パ跄懰?UDCA)；其次考察它對小鼠CCL4肝損傷是否有保護作用，旨在確定藍狐膽汁的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 材料 藍狐膽取自黑龍江省綏化狐貍養(yǎng)殖場。將打皮后的藍狐尸體30只進行解剖，取出膽囊，提取膽汁，37 ℃烘干48 h，獲得藍狐膽汁干粉；取清潔級昆明種小鼠30只(浙江中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心提供，使用許可證：SYXK [浙]2013-0184)，體重18～22 g，雌雄各半。

1.2 儀器與設備

1.2.1 TLC分析 熊膽標準品、熊去氧膽酸(UDCA)標準品由中國藥品生物制品檢定所提供，薄層層析硅膠(青島海洋化工有限公司)、NaOH溶液、甲苯、鹽酸、氯仿、甲醇、丙酮由天津市凱通化學試劑有限公司提供。TLC分析儀器主要包括：顯微鏡、薄層層析玻璃板、層析缸、玻璃點樣毛細管、分析天平、容量瓶、蒸發(fā)皿、量杯、烘干箱等。

1.2.2 CCL4肝損傷 丙氨酸氨基轉移酶試劑盒、草氨酸氨基轉移酶試劑盒、丙二醛試劑盒、總膽固醇試劑盒由上海源葉生物科技有限公司提供。CCL4分析純(國藥集團化學試劑有限公司)，D-氨基半乳糖鹽酸鹽(美國Sigma公司)，生理鹽水(浙江藥業(yè)有限公司)，魯花花生油(山東魯花集團有限公司)，4%甲醛溶液，70%乙醇，護肝片、蒸餾水等。實驗中所用兩種致肝損傷藥物為CCL4溶液，豆油稀釋，配比濃度為20%；D-Galn溶液，生理鹽水稀釋，配比濃度為10%?？垢螕p傷藥物兩種，護肝片(葵花藥業(yè)股份有限公司，國藥準字Z20003336)，主要成分包括豬膽粉、柴胡、茵陳、板藍根、五味子和綠豆。藍狐膽汁粉備用。

實驗儀器包括全自動生化分析儀(Glamour2000，法國)、輪轉式切片機(LeicaRW2235，德國萊卡公司)、分光光度計(722型，浙江高密儀器廠)、投射電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司)、光學顯微鏡(Nikon)、離心機(浙江高密儀器廠)、水浴鍋(上海醫(yī)用分析儀器廠)、電子勻漿機(上海醫(yī)用分析儀器廠)、自動染色儀(LeicaAutoStainerXL，德國萊卡公司)、酶標儀(美國熱電公司)、石蠟包埋機(LeicaEG1160)、烤箱等。

1.3 方法

1.3.1 TLC分析 (1)樣品制備：取精密測定藍狐膽汁粉末50 mg，加8%的NaOH溶液5 ml，120 ℃熱水超聲溶解2 h，滴加鹽酸調節(jié)pH至2～3。再用甲醇超聲提取2次，每次加10 ml，30 min合并提取液，置水浴上蒸發(fā)至干[4]。殘渣加甲醇適量溶解，移至5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。(2)對照品制備:取熊膽標準品、UDCA標準品各5 mg，置1 ml量瓶中。加甲醇溶液，備用。(3)試劑配制:將濃度為80%的NaOH加生理鹽水至10 ml，配制成8%的NaOH溶液。將2 ml濃鹽酸加生理鹽水至10 ml，配制成稀鹽酸。將1.25 g磷鉬酸加無水乙醇至25 ml，制成磷鉬酸乙醇。

1.3.2 實驗分組及CCL4肝損傷處理 取30只昆明種小鼠，分為5組，每組6只。分別為：(1)空白組，非肝損傷處理，投喂蒸餾水，注射無傷害性的豆油；(2)模型組，肝損傷處理，不投喂任何藥物，完全為CCL4急性肝損傷個體；(3)陽性組，肝損傷處理，投喂護肝片，0.4 g/kg；(4)高劑量組，肝損傷處理，投喂高劑量藍狐膽汁粉，10 g/kg；(5)低劑量組，肝損傷處理，投喂低劑量的藍狐膽汁粉，5 g/kg。

肝損傷處理之前，喂藥物的3組分別灌胃給藥， 1次/d，連續(xù)10 d。空白組只投喂同體積的蒸餾水。最后一次給藥前16 h，各組做肝損傷處理。在動物腹腔注射CCL4豆油溶液，2 ml/kg?？瞻捉M只注射同體積的豆油。肝損傷處理后，動物禁食禁水。末次給藥后1 h，將動物斷頭取血，離心，取血清，測定血清中谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)濃度。

1.3.3 肝組織切片染色方法 將實驗動物的肝組織在4% 甲醛溶液中固定24 h，自來水沖洗6 h，用70% 的乙醇浸泡備用。自動脫水機脫水后，用石蠟包埋機包埋，制成組織蠟塊，再用切片機切片，55 ℃烤箱內過夜。充分烘干后，用自動染色儀水化，HE染色，中性樹膠封片，數(shù)字顯微照相機觀察肝小葉機構和細胞形態(tài)，做病理學檢查，并拍攝照片。

2 結 果

2.1 TLC分析結果 圖1顯示，藍狐膽汁中明顯存在3類物質(A、B、C)，其遷移值Rf分別為A=9.5，B=8.0，C=6.5。熊膽汁中也存在3類物質(E、F、G)，其遷移值Rf分別為E=9.5，F(xiàn)=8.0，G=7.4。對比藍狐膽汁與熊膽汁，兩者的相似度約50%，即兩者共四類物質中，有兩類相同。使用UDCA標準品所做的TLC圖譜發(fā)現(xiàn)，該物質(D)的Rf值為D=8.0，說明藍狐膽汁與熊膽汁均存在相同的UDCA。

圖1 藍狐膽汁與熊膽汁TLC圖譜

2.2 藍狐膽汁對CCL4肝損傷的影響

2.2.1 對CCL4肝損傷血清ALT、AST濃度的影響 實驗動物肝被CCL4損傷后，血清AST、ALT濃度明顯增高(表1)，模型組與空白組對比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陽性組(投喂護肝片的個體)與模型組之間AST、ALT指標相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1 藍狐膽汁對CCL4急性肝損傷血清AST、ALT活力的影響 (n=6；

注：與模型組相比，①P<0.05；與空白組相比，②P<0.05

2.2.2 組織病理切片 (1)空白組：肝結構正常，肝小葉中央靜脈清晰，肝細胞形態(tài)未見異常，胞漿豐富。嗜酸紅染，胞核染成藍色，肝竇清晰可見，小葉內未見炎性反應細胞浸潤(圖2A)。(2)模型組：肝細胞變性明顯，大量肝細胞胞漿疏松化，甚至氣球樣變。可見肝細胞點狀壞死，壞死區(qū)有炎性反應細胞浸潤，標志著肝組織已經(jīng)受到損傷(圖2B)。(3)陽性組：肝組織已基本恢復，但仍可見肝細胞輕度水腫(圖2C)。(4)高劑量組：肝細胞仍可見水腫，但未見明顯的炎性反應細胞浸潤(圖2D)。(5)低劑量組：肝細胞有明顯水腫，偶見肝細胞點狀壞死(圖2E)。

圖2 正常小鼠與CCL4急性肝損傷小鼠病理(HE,×400)

3 討 論

CCL4作為導致肝損傷的物質，其致病機制比較復雜，與氧化應激和脂質過氧化等有關[6]。氧化應激反應能生成醛類等副產(chǎn)物，如丙二醛MDA等，它們能與細胞內的蛋白質和DNA結合，最后使細胞受損。脂質過氧化反應的代謝產(chǎn)物是三氯甲基自由基及過氧化三氯甲基自由基，它們能刺激生成Kupffer細胞，釋放促炎性反應因子，使細胞內的轉氨酶AST和ALT溢出，并誘發(fā)結石。肝損傷時ALT會首先進入到血液，而當線粒體損傷嚴重時，AST則大量進入血清。如果這兩種物質超過正常值的2倍，且持續(xù)2周左右，就可以判斷為肝損傷。本研究結果表明，CCL4使小鼠血清AST和ALT濃度上升，意味著小鼠肝已經(jīng)受到比較嚴重的傷害。

本研究結果表明，藍狐膽汁對肝損傷的確具有治療作用。雖然藍狐膽汁中有多種成分，但游離型膽汁酸UDCA應該是藍狐膽汁的主要藥性成分。因為自1961年日本學者首次證實UDCA是熊膽中治療肝損傷的藥性物質以來[3]，人們多次通過實踐證明，UDCA類物質為治療各種肝損傷的特效藥物[3，4]。本研究采用的護肝片是陽性臨床復方中藥，功能主要是疏肝理氣、健脾消食、降低轉氨酶(能使AST下降80.67%，使ALT降低70.37%)，被廣泛用于脂肪肝、乙醇肝、藥物性肝損傷、早期肝硬化等癥的治療。值得注意的是，在其藥用成分(熊膽或豬膽粉20 g，柴胡250 g，茵陳250 g，板藍根250 g，五味子250 g，綠豆128 g)中熊膽粉重量只占1.7%[5]，足見UDCA類物質的藥性作用較大。

按照以往建模經(jīng)驗[7-10]，小鼠腹腔注射20%～50%濃度的CCL4植物油溶液，并按2 ml/kg的劑量，建模效果是最好的，AST和ALT數(shù)值能成倍增加。注射20%濃度的CCL4組，病理切片出現(xiàn)肝損傷典型現(xiàn)象(肝細胞明顯疏松化、氣球樣變、炎性反應細胞浸潤、點狀或塊狀壞死)；注射50%濃度的CCL4組，病理切片除了經(jīng)典現(xiàn)象，還伴有肝纖維化改變。本研究選用20%濃度建模的結果是成功的，能夠滿足實驗的要求，空白組與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，病理切片變化明顯。

綜上所述，藍狐膽汁中含有熊膽有效成分UDCA，無論是高劑量還是低劑量，投喂藍狐膽汁粉的肝受傷小鼠，血液中的AST、ALT濃度均出現(xiàn)明顯下降，說明藍狐膽汁具有很強的護肝作用。

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(2015-03-03收稿 2015-05-20修回)

(責任編輯 郭 青)

Economy class animal blue fox bile for TLC identification and its protection against CCL4hepatic injury

ZHOU Bo1, JIA Jingbo2, and LI Jiaming3.

1.College of Wildlife Resource, Northeast Forestry University, Harbin 150050,China;2.Traditional Chinese Medicine Resources Development and Utilization, College of Pharmacy Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150001,China; 3.Department of Orthopedics the Fifth Hospital in Harbin City of Heilongjiang, Harbin 150051,China

Objective To determine the pharmacological effects of blue fox bile. Method Thirty Kunming mice were divided into 5 groups, each group of six. (1)For the blank group, without the liver damage treatment, was fed on distilled water, and harmless soybean oil was injected. (2) For the model group with liver damage, no drugs were given, were completely CCL4acute liver injury individuals. (3) For positive group with liver damage were fed on liver-protecting, 0.4/kg. (4) For the high dose group with liver damage was fed on high dose of blue fox bile powder, 10 g/kg. (5) For the low dose group with liver damage was fed on the low dose of blue fox bile powder, 5 g/kg. The first study was using TLC method, to determine whether the blue fox bile contained ursodeoxy cholic acid (UDCA). The second study was to determine whether the blue fox bile has a protective effect on CCL4caused hepatic injury in mice. Results The similarity between blue fox bile and bear bile is about 50%, both with two kinds of material, the same in the four kinds of material. Blue fox UDCA component is contained in bile. After experimental animals were inflicted on injury of the liver by CCL4, AST and ALT in serum concentration significantly increased; the difference between the model group and the blank group was statistically significant. Through pharmacological results and pharmacological slices, it can be seen that CCL4caused AST, ALT concentration effect acute liver injury can be inhibited in mice. Conclusions Blue fox bile can repair injury of liver cells and has obvious protective effects on the liver.

blue fox bile; AST; ALT; CCL4liver damage

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12531656)

周 博，博士，講師，E-mail：251461104@qq.com

1.150050 哈爾濱，黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院；2.150001 哈爾濱，東北林業(yè)大學野生動物資源學院；3.150051，哈爾濱市第五醫(yī)院

賈競波，E-mail:Jiajingbo2011@163.com

R961.1