乙肝相關(guān)性肝癌MLH1與p53的表達(dá)及其意義

王培曉，張 慶，張 力，張 慧，陳 虹，黃麗虹

乙肝相關(guān)性肝癌MLH1與p53的表達(dá)及其意義

王培曉1，2，張 慶2，張 力3，張 慧4，陳 虹2，黃麗虹5

目的 探討MLH1與p53在乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus ，HBV) 感染相關(guān)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表達(dá)及其意義。方法 選取原位肝移植手術(shù)術(shù)后HBV相關(guān)性HCC伴肝硬化患者238例，應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織中MLH1與p53的表達(dá)情況，并以25例正常肝組織和良性肝病組作為對(duì)照。結(jié)果 MLH1在肝癌組織的陽性表達(dá)率為31.09%(74/238)，在癌旁組織的表達(dá)陽性率為26.05%(62/238)，良性肝病對(duì)照組陽性表達(dá)率為48.00%(12/25)，各組表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.053)。相關(guān)性分析顯示，MLH1基因的表達(dá)與患者肝移植術(shù)前AFP含量(r=0.221，P=0.001)及術(shù)后的復(fù)發(fā)(r=-0.159，P=0.014)有相關(guān)性，與HCC組織病理學(xué)Edmondson分級(jí)(P=0.060)及TNM分期(P=0.065)有相關(guān)趨勢(shì)。p53在肝癌組織的表達(dá)陽性率為47.06%(112/238)，在癌旁組織的表達(dá)陽性率為0.84%(2/238)，良性肝病對(duì)照組均為陰性，p53蛋白的表達(dá)在癌組織中明顯高于其在癌旁及良性肝病中的表達(dá)(P=0.000)；p53表達(dá)情況與患者肝移植術(shù)前AFP含量有相關(guān)性(r=0.172，P=0.008)，與血管侵犯(P=0.053)及腫瘤數(shù)量(P=0.051)有相關(guān)趨勢(shì)。結(jié)論 MLH1蛋白表達(dá)下調(diào)可能與HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生及術(shù)后的復(fù)發(fā)有關(guān)，且MLH1與p53蛋白在肝癌中的表達(dá)有一定的關(guān)聯(lián)性。

肝細(xì)胞肝癌；乙型肝炎病毒；MLH1；p53；免疫組化

肝癌是世界上第5位常見惡性腫瘤，全球每年有近50萬人死于肝癌,是近10年來發(fā)病率上升最快的腫瘤疾病之一，其病死率位于因癌癥死亡疾病的第3位[1]。中國(guó)是肝癌的高發(fā)區(qū)，約80%以上肝癌發(fā)生與慢性HBV感染有關(guān)，10%與非乙肝非丙肝性因素相關(guān)。然而，肝癌的復(fù)發(fā)率較高，進(jìn)展迅速，目前肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不十分明確[2]。MLH1與p53均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)且均可能與肝癌相關(guān)，但關(guān)于MLH1與p53蛋白在HBV相關(guān)性HCC中的表達(dá)未見系統(tǒng)報(bào)道[3-16]。為此，筆者探究MLH1與p53在HBV相關(guān)性HCC中表達(dá)及其意義，并探究它們與臨床病理特征間的相關(guān)性，以及兩者在HBV相關(guān)性HCC發(fā)生發(fā)展中是否有關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料 2003-01至2013-12在北京武警總醫(yī)院行肝移植的患者238例，其標(biāo)本蠟塊保存較好且組織病理報(bào)告為HBV相關(guān)性HCC。手術(shù)標(biāo)本經(jīng)40 g/L中性甲醛溶液固定、石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組化染色。同時(shí)，隨機(jī)選取5例正常肝組織(健康供肝者的肝穿標(biāo)本)及20例良性肝病(酒精性肝硬化5例、布加綜合征5例、肝豆?fàn)詈俗冃?例和自身免疫性肝病5例)組織作為對(duì)照組，良性肝病為臨床上確診的病例。此外，均設(shè)陽性對(duì)照及用 P B S 緩沖液代替一抗做陰性對(duì)照。一抗p53蛋白抗體是鼠抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：ZM-0408，規(guī)格為0.1 ml裝原液)。MLH1蛋白抗體是兔抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：ZM-0154，規(guī)格為0.1 ml裝原液)。二抗為通用型kit，PV-6000 山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：PV-6000，規(guī)格為18 ml)。石蠟切片機(jī)(孝感市宏業(yè)醫(yī)用器械BM-VX)，電熱常溫干燥箱(上海一恒隔水式GHP-9080)，顯微鏡(OLYMPUS CX21)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 根據(jù)PV-6000一步法試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)步驟進(jìn)行。一抗稀釋度為p53(1∶150)、MLH1(1∶165)。

1.2.2 p53蛋白和MLH1蛋白染色結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) p53和MLH1陽性染色呈棕黃色顆粒。p53定位于細(xì)胞核，MLH1定位于細(xì)胞核，強(qiáng)度表達(dá)按陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度由弱至強(qiáng)分別記分，細(xì)胞核無黃色顆粒樣沉淀為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、深棕黃色為3分；陽性細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)的值：將陽性的細(xì)胞數(shù)<5%算為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；然后將染色強(qiáng)度+陽性細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)的值作為評(píng)分，0分為陰性，1～2分為+，3～4分為++，5～6分為+++。

1.2.3 復(fù)發(fā)判斷指標(biāo) 術(shù)后通過每月復(fù)查肝臟B超、胸片和血清AFP水平等方法，檢查患者腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況, 發(fā)現(xiàn)可疑癌灶或陽性結(jié)果后立即行CT、MRI或PET-CT檢查。每3～6個(gè)月復(fù)查一次胸、腹部CT或核磁檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)及Spearman秩相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化結(jié)果

2.1.1 MLH1蛋白在HBV相關(guān)性HCC中的表達(dá)情況 MLH1定位于細(xì)胞核(圖1A、B)，陽性染色呈棕黃色顆粒。癌組織：陰性(-)164例，弱陽性(+)31例，中等陽性(++)33例，強(qiáng)陽性(+++)10例，各部分所占構(gòu)成比為68.91%、13.02%、13.87%和4.20%。在癌旁組織：陰性(-)176例，弱陽性(+)3例，中等陽性(++)36例，強(qiáng)陽性(+++)23例，表達(dá)陽性率為26.05%。在良性肝病及供肝中的表達(dá)陽性率48.00%(12/25)，陰性(-)14例，弱陽性(+)5例，中等陽性(++)6例，強(qiáng)陽性(+++)5例?？ǚ綑z驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.056)。

圖1 MLH1與p53在HBV相關(guān)性HCC組織中陽性表達(dá)

2.1.2 p53蛋白在HBV相關(guān)性HCC中的表達(dá)情況 p53定位于細(xì)胞核(見圖1C、D)，癌組織：陰性(-)126例，弱陽性(+)17例，中等陽性(++)42例，強(qiáng)陽性(+++)53例，表達(dá)陽性率為47.06%。在癌旁組織：陰性(-)236例，弱陽性(+)0例，中等陽性(++)1例，強(qiáng)陽性(+++)1例，表達(dá)陽性率為0.84%。在25例對(duì)照組中的表達(dá)為0。肝癌組織中p53的表達(dá)與其在癌旁和良性肝病組織中的表達(dá)有差異(P=0.000)。

2.1.3 MLH1蛋白與p53蛋白在HBV相關(guān)性HCC中的表達(dá)相關(guān)性分析 應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析MLH1與p53有一定的相關(guān)性(r=0.195，P=0.013)。其中，蛋白表達(dá)強(qiáng)陽性比例p53蛋白(21.85%)明顯高于MLH1蛋白(4.20%)(P=0.000)；相反，蛋白表達(dá)陰性及弱陽性比例MLH1(81.52%)明顯高于p53蛋白(60.08%)(P=0.000)；蛋白表達(dá)中等陽性分別為MLH1(13.87%)和p53蛋白(17.65%)，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.258)。

2.2 p53蛋白和MLH1蛋白的表達(dá)情況與HBV相關(guān)性HCC的臨床病理特征的分析 見表1。p53表達(dá)情況與臨床病理特征相關(guān)性分析表明，AFP含量存在一定的相關(guān)性(r=0.172，P=0.008)，與血管侵犯(P=0.053)及腫瘤數(shù)量(P=0.051)有相關(guān)趨勢(shì)；MLH1蛋白表達(dá)通過與臨床病理特征的等級(jí)相關(guān)性分析，MLH1基因的表達(dá)與HBV-HCC肝移植術(shù)后的復(fù)發(fā)(r=-0.159，P=0.014)及AFP含量(r=0.221，P=0.001)有一定的相關(guān)性，與組織病理分級(jí)(P=0.060)及TNM分期(P=0.065)有相關(guān)趨勢(shì)，而與HBeAg、血管侵犯、淋巴侵犯、腫瘤數(shù)量等無明顯的相關(guān)性。

表1 乙肝相關(guān)性肝癌MLH1與p53表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系 (n=238)

注：r為相關(guān)系數(shù),P為r取值概率

3 討 論

肝癌的發(fā)生和演變是多階段和多基因參與的極為復(fù)雜的生物學(xué)過程，其中DNA損傷的修復(fù)是重要的一環(huán)，若DNA損傷未能及時(shí)得到修復(fù)致使損傷積累，導(dǎo)致基因的功能改變，將會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)在修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配、增強(qiáng)DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性、維持基因穩(wěn)定性和降低自發(fā)性突變防止損傷積累方面上有著重要的作用[3]。其中MLH1基因是MMR中重要的一個(gè)功能基因，對(duì)于MMR的功能發(fā)揮有著重要影響[4-7]。多數(shù)研究都是應(yīng)用的細(xì)胞遺傳學(xué)方法技術(shù)，例如基因雜交或者PCR等，只有少數(shù)的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用免疫組化的方法揭示MLH1基因表達(dá)分布與肝癌的關(guān)系[5-9]。

本研究中238例HBV相關(guān)性HCC病例中，免疫組化結(jié)果中MLH1蛋白表達(dá)部位在細(xì)胞核，表達(dá)陽性率為30.77%，但通過與癌旁及良性肝病的比較并未發(fā)現(xiàn)明顯的差異性，MLH1基因表達(dá)與肝癌患者的臨床病理特征：HBeAg、血管侵犯、淋巴侵犯、腫瘤數(shù)量等亦無明顯的相關(guān)性，但MLH1基因的表達(dá)與HBV相關(guān)性HCC肝移植術(shù)前AFP含量與術(shù)后復(fù)發(fā)有一定的相關(guān)性，與組織分級(jí)及TNM分期有相關(guān)趨勢(shì)，說明表達(dá)減少可能會(huì)促進(jìn)肝癌的復(fù)發(fā)及腫瘤的惡化。有研究顯示[5-7]，MLH1基因在HCV感染相關(guān)性肝癌中的表達(dá)陽性率分別為75%、80%及93.41%，且其表達(dá)與肝癌發(fā)生、發(fā)展無明顯相關(guān)性。但其中只是部分涉及HBV相關(guān)性HCC。另外有研究也從另一方面支持這一結(jié)論，甲基化導(dǎo)致的基因沉默促進(jìn)DNA損傷積累的作用在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中并不明顯[8]。Helal TE等[9]的研究中50例HCV相關(guān)性肝癌病例中24例MLH1蛋白陽性，陽性率為48%。在該研究中支持MLH1基因低表達(dá)在肝癌發(fā)生發(fā)展中有明顯相關(guān)性，特別是在高去分化的肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，有研究[7]也支持在分化程度較差的肝癌中MLH1明顯減少。不同的結(jié)果可能是對(duì)照的良性肝病組病例數(shù)太少，或者因?yàn)樗每贵w種類和病例來源不同所致，特別是病例來源，病例的種族差異、地域差異及病毒感染的不同基因型等。而且肝癌的發(fā)生發(fā)展本就是一個(gè)多步驟多因素多基因參與的過程，可能在某一環(huán)節(jié)有MLH1基因的參與，在肝癌的進(jìn)展過程中，惡性改變過程中及肝移植術(shù)后的復(fù)發(fā)過程中有該基因的參與。

國(guó)內(nèi)外研究顯示[10，11]，野生型p53參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷與修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及細(xì)胞分化等多個(gè)過程，并且有抑制腫瘤新生血管的作用。而突變型的p53卻有促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的作用，p53基因突變出現(xiàn)于50%的腫瘤患者，并其還有一部分的患者雖無p53 突變但也經(jīng)常有 p53 通路的部分失活。在肝癌的發(fā)生發(fā)展中同樣有著重要的作用[12]。在人群中研究HBV感染單獨(dú)因素能否引起p53突變有一定難度，因?yàn)樵谥袊?guó)HBV感染高流行區(qū)域大多也是黃曲霉毒素水平高的地區(qū)，因?yàn)橛衅渌祀s因素的存在，如今的研究也是結(jié)果不盡相同[13]。突變型p53基因在乙肝相關(guān)性肝癌中的表達(dá)尚不明確，相關(guān)研究較少且樣本例數(shù)較少，在HBV相關(guān)性HCC中突變型p53分別為4/8與6/11[14，15]。本研究通過對(duì)238例乙肝相關(guān)性肝癌患者的組織應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)p53的表達(dá)。結(jié)果顯示p53主要表達(dá)部位為癌細(xì)胞核上，陽性率為47.06%，而僅2例p53在癌旁呈陽性表達(dá)，在30例良性肝病和健康供肝組中均為陰性。與HBV-HCC患者的臨床病理特征分析：p53表達(dá)情況與臨床病理特征相關(guān)性分析AFP含量存在一定的相關(guān)性，與血管侵犯有相關(guān)趨勢(shì)。

本研究結(jié)果顯示MLH1蛋白與p53蛋白表達(dá)有相關(guān)性。有研究表明DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)基因MLH1主要通過激活p53和線粒體調(diào)亡通路參與雌激素誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116凋亡，具有激活p53通路的作用，且顯示順鉑、烷化劑等多種損傷DNA介質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有MMR基因與p53等相關(guān)基因的協(xié)同作用[16]。推測(cè)：MLH1基因與p53基因在HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有協(xié)同作用，但其具體機(jī)制還不甚清楚。

綜上所述，MLH1蛋白表達(dá)下調(diào)可能與HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生及術(shù)后的復(fù)發(fā)有關(guān)，并且MLH1與p53蛋白在肝癌中的表達(dá)有一定的關(guān)聯(lián)性。p53蛋白在HBV相關(guān)性肝癌的組織中表達(dá)的程度及強(qiáng)度較MLH1蛋白特異性強(qiáng)。推測(cè)MLH1基因與p53基因可能協(xié)同參與HBV相關(guān)性肝癌發(fā)生發(fā)展。但相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步的探究。

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(2015-02-09收稿 2015-03-24修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

Significance of MLH1 and p53 expression in HBV related- hepatocellular carcinoma

WANG Peixiao1,2,ZHANG Qing2,ZHANG Li3,ZHANG Hui4,CHEN Hong2,and HUANG Lihong5.

1.Graduate Division of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003,China;2.Institute of Organ Transplantation, 5.The Graduate Student Affairs Office，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039,China;3.First Department of Surgery, Shaanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Xi’an 710054, China；4.Department of Gastroenterology ，Luoyang Dongfang Hospital，Luoyang 471003,China

Objective To study the expression of MLH1 and p53 in HBV related- hepatocellular carcinoma(HCC), both of the specificity of the expression. Method Objects were 238 patients of HBV related-HCC with cirrhosis in this hospital who had been in the liver transplantation operation from 2003 to 2013. We examined the expression of MLH1 and p53 in 238 patients with HCC and adjacent tissues by immunohistochemistry.As the normal controls were normal liver tissue and benign liver disease. Results The expression of theMLH1postive in the HCC tissues was 31.09%(74/238), with 26.05%(62/238) in cancer adjacent tissues，with 48.00%(12/25)in benign liver diseases tissues. The expression in each group had no significant difference (P=0.053). However,by clinicopathologic rank correlation analysis， the expression of MLH1 was associated with tumour recurrence after liver transplantation (r=-0.159，P=0.014)and the AFP levels (r=0.221,P=0.001),and had certain trend with Edmondson-Steiner Grading(P=0.060)and TNM(P=0.065). The expression of the p53 postive in the HCC tissues was 47.06%(112/238),with 0.84%(2/238)in the cancer adjacent. However, the expression of benign liver diseases tissues were all negative.The expression of p53 protein in tumour tissues was significantly higher than that in cancer adjacent tissues and benign liver diseases tissues (P=0.000),There was association between expression of p53 and vascular invasion (P=0.053) and tumorons numbers (P=0.051). Conclusion Down-regulation of MLH1 expression at the mRNA and protein levels is observed in association with developing hepatocellular carcinoma and relapses. MLH1 has significant correlation with p53.

hepatocellular carcinoma; HBV; MLH1; p53; Immunohistochemistry

首都臨床特色應(yīng)用研究項(xiàng)目(Z121107001012168)、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81372595)

王培曉，碩士，E-mail:995816449@qq.com

1.453003，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生院；100039 北京，武警總醫(yī)院:2.肝移植科，5.研究生辦；3.710054 西安，武警陜西總隊(duì)醫(yī)院普通外科；4.471003，洛陽東方醫(yī)院消化肝病科

黃麗虹,E-mail:xiao.1015.y@qq.com

R730.23