針刺干預(yù)對(duì)腦缺血大鼠腦組織低氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白和mRNA表達(dá)的影響

朱在卿，許貴剛，郭艷麗，馬 斌，盧 巖

針刺干預(yù)對(duì)腦缺血大鼠腦組織低氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白和mRNA表達(dá)的影響

朱在卿1，許貴剛1，郭艷麗1，馬 斌1，盧 巖2

目的 觀察針刺干預(yù)對(duì)腦缺血大鼠腦組織缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白及mRNA表達(dá)的影響，探討針刺對(duì)缺血性腦血管疾病的防治機(jī)制。方法 建立局灶性腦缺血大鼠模型，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、針刺組(各8只大鼠)，應(yīng)用蛋白印跡及實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)針刺對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果 正常組和假手術(shù)組大鼠比較HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，模型組大鼠HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;針刺組大鼠HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)高于模型組(0.567±0.058vs0.315±0.118; 1.593±0.102vs1.193±0.259)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 腦缺血后大鼠腦組織HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)增強(qiáng)，針刺可以上調(diào)其表達(dá)從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

局灶性腦缺血；針刺；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

缺血性腦血管病是常見(jiàn)病、多發(fā)病，如何減輕腦缺血后腦組織損傷，提高神經(jīng)元對(duì)缺血缺氧的耐受，是目前研究的熱點(diǎn)。低氧誘導(dǎo)因子-1 α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)可通過(guò)對(duì)靶基因的誘導(dǎo)表達(dá)，調(diào)控機(jī)體產(chǎn)生一系列適應(yīng)低氧反應(yīng)的變化。因此，筆者從電針干預(yù)大鼠腦缺血后HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)的研究入手，為針刺治療缺血性腦血管病的機(jī)制研究探索新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性大鼠[Wistar，SPF級(jí)，(220±20) g]32只[購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]。在室溫25℃左右、相對(duì)濕度為40%～60%條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 江灣Ⅰ型C立體定位儀(上海川沙花木農(nóng)機(jī)廠)、韓氏疼痛治療儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)、光學(xué)顯微鏡(奧林帕斯BX51，日本)、qPCR儀(7500 Fast，Applied biosystems，USA)、電泳儀(BIO-Rad，美國(guó))、凝膠成像儀(2500，Tanon公司)、TRIzol Reagent(15596-018，Invitrogen公司)、superscript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒(18080-044，Invitrogen公司)。

1.3 造模方法及針刺處理 大鼠隨機(jī)分為模型組、針刺組、正常組和假手術(shù)組，每組各8只大鼠。針刺組和模型組大鼠采用線栓大腦中動(dòng)脈(MCAO)復(fù)制局灶性腦缺血大鼠模型，模型制作方法根據(jù)文獻(xiàn)[1,2]方法并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室操作的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行改良。假手術(shù)組除了不插入線栓，其他與模型復(fù)制手術(shù)過(guò)程相同，正常組大鼠不予任何手術(shù)操作。造模后大鼠參照Z(yǔ)ea Longa的神經(jīng)體征評(píng)分方法[3]評(píng)價(jià)MCAO大鼠運(yùn)動(dòng)功能。無(wú)神經(jīng)缺損體征為0分；不能充分屈曲左側(cè)前爪為1分；向左側(cè)轉(zhuǎn)評(píng)為2分；可向左側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，并意識(shí)喪失為4分，評(píng)分1～3分為模型制作成功。

針刺組大鼠分別取雙側(cè)“曲池”和“內(nèi)關(guān)”穴進(jìn)行針刺。穴位定位參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)研究制訂的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位定位標(biāo)準(zhǔn)及擬人對(duì)照法定位[4]：內(nèi)關(guān)穴定位于前肢內(nèi)側(cè)，距腕關(guān)節(jié)約3 mm處的尺橈骨縫間，曲池定位于橈骨近端，肘關(guān)節(jié)外前方的凹陷中。將大鼠固定在自制的固定器上，內(nèi)關(guān)穴直刺1 mm，曲池穴直刺4 mm，連接韓氏疼痛治療儀，采用2/15 Hz的疏密波，刺激電流為1 mA，留針20 min，1次/d，連續(xù)針刺7 d。

1.4 腦組織的制備及HIF-1α的檢測(cè)

1.4.1 腦組織的制備 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠麻醉后(n=5)用生理鹽水經(jīng)左心室升主動(dòng)脈灌注，然后用4%多聚甲醛溶液(pH7.4)緩慢灌注固定，取腦。于大腦中動(dòng)脈起始處向后取約1 cm厚的冠狀面腦片，投入4%多聚甲醛溶液固定，脫水，透明、浸蠟，石蠟包埋，切片5 μm。大鼠(n=3)麻醉后，直接在冰盤(pán)上快速取腦，同樣于大腦中動(dòng)脈起始處取約8 mm的缺血側(cè)腦組織，分為二等份，稱(chēng)重后于-80 ℃冰箱中保存，分別進(jìn)行HIF-1α蛋白和 mRNA的檢測(cè)。

1.4.2 組織病理學(xué)檢查 石蠟切片經(jīng)過(guò)二甲苯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ脫蠟， 95%，90%和70%的梯度乙醇脫水，HE染色，在顯微鏡下觀察缺血側(cè)腦組織的變化。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡(Western Blot) 將各組大鼠腦組織加入RIPA裂解液，進(jìn)行提取總蛋白。經(jīng)過(guò)12%SDS-PAGE膠電泳，然后再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、雜交和曝光。應(yīng)用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶灰度進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量[Real-time Quantitative PCR Detecting System (QPCR) ] 取大鼠腦組織，用Trizol(Invitrogen)提取總RNA，采用superscript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。ABI 7500 Fast進(jìn)行HIF-1α擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包括：cDNA 1 μl，10X Buffer 2 μl，Mg2+1 μl，Primer-F(10 μM) 1μl，Primer-R(10 μM) 1μl，Sybgreen(20X) 1 μl，ddH2O 12.8 μl，Taq 0.2 μl，于ABI 7500 Fast qPCR儀上反應(yīng)。由Primer Premier 5.0軟件(Premier公司，加拿大)設(shè)計(jì)引物，HIF-1α(NM_024359.1)引物序列為 F-CTGTGGGGTTTCGTTTCTGT, R-GGACAAACTCCCTCACCAAA。ABI 7500 Fast自帶系統(tǒng)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，針刺治療前后組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，針刺治療后各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者用LSD法，方差不齊者用Tamhan T2法進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 針刺對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能的影響 正常組和假手術(shù)組大鼠飲食正常，活動(dòng)自如，毛色有光澤，神經(jīng)體征無(wú)異常。模型組大鼠進(jìn)食量及體重明顯下降，毛色晦澀，不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢，提尾倒立時(shí)身體彎向?qū)?cè)，前肢下垂等。針刺組上述腦缺血的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能明顯恢復(fù)。采用神經(jīng)體征評(píng)分評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的程度，模型組大鼠神經(jīng)體征評(píng)分均高于正常組和假手術(shù)組，表明模型組大鼠運(yùn)動(dòng)功能存在缺損。針刺組大鼠神經(jīng)體征評(píng)分低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明針刺組大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)顯著(表1)。

表1 針刺對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)體征評(píng)分的影響 (分

注：與正常組比較，①P<0.05；與假手術(shù)組比較，②P<0.05；與模型組比較，③P<0.05；與治療前比較，④P<0.05

2.2 腦組織大體及鏡下改變 正常組及假手術(shù)組大鼠腦組織外觀正常，無(wú)明顯變化。HE切片未見(jiàn)明顯組織病理改變，大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞層次清晰，大小正常，形態(tài)完整，神經(jīng)細(xì)胞及毛細(xì)血管周?chē)g隙正常，未見(jiàn)梗死區(qū)。模型組大鼠腦組織呈現(xiàn)不同程度的萎縮、液化及壞死，腦皮質(zhì)可見(jiàn)大片的梗死區(qū)，細(xì)胞排列不規(guī)則間隙疏松，大量膠質(zhì)細(xì)胞及血管增生，部分大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞核固縮壞死，甚至片狀消失。針刺組大鼠神經(jīng)壞死數(shù)量減少(圖1)。

圖1 大鼠海馬病理改變(×100, HE染色)

2.3 針刺對(duì)MCAO大鼠缺血腦組織中HIF-1α的影響 結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織HIF-1α蛋白和mRNA的表達(dá)與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組大鼠腦組織HIF-1α蛋白表達(dá)上調(diào)，但與正常組和模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組大鼠腦組織HIF-1αmRNA的表達(dá)上調(diào)，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；針刺組大鼠腦組織HIF-1α蛋白和mRNA的表達(dá)上調(diào)，顯著高于模型組、正常組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2，圖2)。

組別HIF-1α蛋白表達(dá)相對(duì)定量值HIF-1αmRNA2-△△Ct值正常組0.278±0.1571.000±0.000假手術(shù)組0.221±0.1400.932±0.075模型組0.315±0.1181.193±0.259②針刺組0.567±0.058①②③1.593±0.102①②③

注：與正常組比較，①P<0.05；與假手術(shù)組比較，②P<0.05；與模型組比較，③P<0.05

圖2 各組大鼠缺血側(cè)腦組織HIF-1α的蛋白表達(dá)

3 討 論

缺血缺氧性腦血管疾病是導(dǎo)致人類(lèi)致死、致殘的重要原因，其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。針刺具有明確的保護(hù)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的作用[5]，低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor -1α，HIF-1α)作為關(guān)鍵的缺氧感受因子，參與了腦缺血缺氧過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)外代謝平衡起著至關(guān)重要的作用，它可能是針刺對(duì)缺血缺氧性腦損傷具有保護(hù)作用的重要靶點(diǎn)。本研究探討了針刺對(duì)局灶性腦缺血大鼠HIF-1α蛋白和mRNA表達(dá)的影響。

HIF-1α作為低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子，在生物體的氧供應(yīng)、細(xì)胞代謝、心血管發(fā)育，以及一系列疾病的生理病理中起重要作用，發(fā)揮多水平的調(diào)節(jié)作用[6]。HIF-1α可調(diào)控多種低氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，參與低氧反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，在缺血性腦血管疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，主要通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因及其產(chǎn)物的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。有報(bào)道HIF-1α激活后可誘導(dǎo)數(shù)百個(gè)靶基因的表達(dá)，這些靶基因的蛋白產(chǎn)物涉及血管的生成和重塑、能量代謝、血管舒縮反應(yīng)、細(xì)胞增殖和存活等多個(gè)方面[7,8]。目前，HIF-1α被認(rèn)為是腦缺血后一系列反應(yīng)的核心因素之一。近年來(lái)，HIF-1α在腦缺血中的神經(jīng)保護(hù)作用被廣泛報(bào)道[9-11]，采用藥物誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)對(duì)腦缺血損傷具有神經(jīng)保護(hù)性作用，通過(guò)基因調(diào)控或藥物干預(yù)的方法提高HIF-1的活性，可改善腦缺血癥狀[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，針刺組HIF-1α蛋白和mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)，與假手術(shù)組、模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腦組織病理學(xué)結(jié)果顯示針刺組大鼠腦組織壞死明顯減少，針刺組大鼠神經(jīng)體征具有明顯的改善，這些結(jié)果表明針刺可以通過(guò)上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，增加相關(guān)靶基因的表達(dá)，改善腦缺血區(qū)的微循環(huán)，發(fā)揮保護(hù)大腦缺血組織的作用。

微循環(huán)是影響缺血所致組織細(xì)胞損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13]。針刺可顯著增加腦缺血大鼠微循環(huán)血流量，改善其神經(jīng)體征[1,2]，其機(jī)制可能為HIF-1α調(diào)控其下游靶基因如VEGF、內(nèi)皮素-1(ET-1)等[14,15]，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管舒縮反應(yīng)改善局部血液循環(huán)，促進(jìn)缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)的形成，增加缺血區(qū)的血氧供應(yīng)，從而保護(hù)神經(jīng)元。HIF-1α對(duì)相關(guān)靶基因的調(diào)控規(guī)律及針刺干預(yù)后的效應(yīng)是筆者下一步將要進(jìn)行研究的課題。

[1] LU Yan，WANG Shi Jun，SONG Xiu Tao.Effects of electroacupuncture on glucose transporter-1 expression of hippocampal microvascular endothelial cells in rats with focal cerebral ischemia[J].Zhen Ci Yan Jiu，2010，35(2)：118-123.

[2] 盧 巖，趙海軍，王 媛，等.電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能、腦血流及腦組織細(xì)胞色素P450表氧化酶基因表達(dá)的影響[J].針刺研究，2014， 39(5)：345-350.

[3] Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J].Stroke，1989，20(1)：84-91.

[4] 郭 義，方劍喬.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2012：46-49.

[5] 唐 曦，唐成林，徐放明，等.頭針聯(lián)合體針對(duì)亞急性期腦卒中患者肢體功能的影響[J].針刺研究，2012，37(6)：488-492.

[6] Sharp F R，Bernaudin M.HIF1 and oxygen sensing in the brain [J].Nat Rev Neurosci， 2004，5(6)：437-448.

[7] Shams I，Nevo E，Avivi A.Ontogenetic expression of erythropoietin and hypoxia-inducible factor-1 alpha genes in subterranean blind mole rats[J].FASEB J，2005，19(2)：307-309.

[8] Ran R，Xu H，Lu A，etal.Hypoxia preconditioning in the brain[J].Dev Neurosci， 2005，27(2-4)：87-92.

[9] Siddiq A，Aminova L R，Troy C M，etal.Selective inhibition of hypoxia-inducible factor (HIF) prolyl-hydroxylase 1 mediates neuroprotection against normoxic oxidative death via HIF-1and CREB-independent pathways[J].J Neurosci，2009，29(27)：8828-8838.

[10] Siddiq A，Ayoubia I A，Chavez J C，etal.Hypoxia-inducible factor prolyl 4-hydroxylase inhibition. A target for neuroprotection in the central nervous system [J].J Biol Chem，2005，280(50)：41732-41743.

[11] Zhou D，Matchett G A，Jadhav V，etal.The effect of 2-methoxyestradiol a HIF-1 alpha inhibitor, in global cerebral ischemia in rats[J].Neurol Res，2008，30(3)：268-271.

[12] Rey S，Semenza G L.Hypoxia-inducible factor-1-dependent mechanisms of vascularization and vascular remodelling[J].Cardiovasc Res，2010，86(2)：236-242.

[13] Lo E H，Dalkara T，Moskowitz M A.Mechanisms，challenges and opportunities in stroke[J].Nat Rev Neurosci，2003，4(5)：399-415.

[14] Ke X J，ZhanG J J.Changes in HIF-1alpha，VEGF，NGF and BDNF levels in cerebrospinal fluid and their relationship with cognitive impairment in patients with cerebral infarction[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2013，33(3)：433-437.

[15] Valle-Casuso J C， Gonzalez-Sanchez A，Medina J M，etal.HIF-1 and c-Src mediate increased glucose uptake induced by endothelin-1 and connexin43 in astrocytes[J].PLoS One，2012，7(2)： e32448.

(2014-02-19收稿 2015-03-23修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

Effects of acupuncture on hypoxia inducible factor -1α and local cerebral blood flow in rats with focal cerebral ischemia

ZHU Zaiqing1, XU Guigang1, GUO Yanli1, MA Bin1, LU Yan2.

1.Department of Neurology, Shandong Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces,Jinan 250014,China;2.Department of Experimental Acupuncturology,College of Acumox and Tuina,Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

Objective To observe the effect of acupuncture on hypoxia inducible factor -1α and local cerebral blood flow in rats with focal cerebral ischemia.Methods Wistar rats were randomly divided into four groups:normal group, sham-operated group, model group and electroacupuncture(EA) group. Focal cerebral ischemia rat models were developed by middle cerebral artery occlusion(MCAO )with thread embolus. Electroacupuncture was applied to bilateral PC 6 and LI11 after MCAO. The expression of hypoxia inducible factor -1α was examined in MCAO rats by Western blot and real-time quantitative PCR (qPCR).Results Acupuncture could promote the recovery of neurological function in MCAO rats. Western blot and real-time qPCR showed that acupuncture promoted the hypoxia inducible factor -1α expression in the ischemic brain tissue with statistical significance(P<0.05).Conclusion Acupuncture promotes hypoxia inducible factor -1α expression in rats with focal cerebral ischemia. All the results suggest that the increased expression of hypoxia inducible factor -1α in the ischemic brain tissue plays an important role in brain protection.

electroacupuncture; focal cerebral ischemia;hypoxia inducible factor -1α

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81102652)，山東省自然科學(xué)基金(ZR2009CQ007)。

朱在卿，本科學(xué)歷，副主任醫(yī)師，E-mail:13969176990@139.com

1.250014 濟(jì)南，武警山東總隊(duì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2.250355 濟(jì)南，山東中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院

盧 巖，E-mail:luyanchinapenglai@126.com

R245.0