散沫花葉總黃酮、多酚含量測定及體外抗氧化活性研究

姜洪芳, 石寶俊， 張鋒倫， 陳 蕾, 施國新, 張衛(wèi)明*

(1.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇 南京 210042； 2.南京師范大學, 江蘇 南京 210046)

散沫花葉總黃酮、多酚含量測定及體外抗氧化活性研究

姜洪芳1,2, 石寶俊1， 張鋒倫1， 陳 蕾1, 施國新2*, 張衛(wèi)明1,2*

(1.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇 南京 210042； 2.南京師范大學, 江蘇 南京 210046)

用55%乙醇回流提取散沫花葉中的活性物質(zhì)，采用比色法測定提取物中的總黃酮及多酚含量，測定了其對DPPH、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除能力和還原力等抗氧化活性指標。結(jié)果表明，散沫花葉提取物中的總黃酮(以蘆丁計)、多酚(以沒食子酸計)含量分別為39.42 mg/g、 116.20 mg/g，提取物具有一定的抗氧化活性，且抗氧化活性與提取物濃度存在量效關(guān)系，本研究為散沫花葉作為低毒高效的天然抗氧化劑應用提供了依據(jù)。

散沫花葉；提取物；總黃酮；多酚；抗氧化活性

散沫花(LawsoniainermisLinn.)為千屈菜科散沫花屬多年生灌木，原產(chǎn)于熱帶、亞熱帶地區(qū)，廣泛分布于中東、北非，印度西部、巴基斯坦、摩洛哥、也門、伊朗、蘇丹及利比亞是其商業(yè)栽培的的重要產(chǎn)地，我國廣東、廣西、江蘇、浙江、云南、福建、臺灣等省也有栽培，其葉、花、果實、種子都可以作為傳統(tǒng)中藥使用，是維吾爾醫(yī)常用藥材之一，收載于衛(wèi)生部頒標準維藥分冊，以葉入藥，是一種很有利用價值的植物，葉可制成紅色染料，用于染發(fā)護發(fā)，是最早用來染發(fā)的植物染發(fā)劑之一；古代阿拉伯人用其樹皮治黃疽病及精神?。蝗~搗碎外敷有止痛、消腫、化膿的功效；種子提取物對大腦有緩慢的興奮作用，可用于記憶力差或全身精神功能不足的治療?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)散沫花含有醌、苯丙素、黃酮、三萜、酚酸和脂肪酸等多種類型的化合物，并具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗寄生蟲等廣泛的藥理活性，有很大的開發(fā)利用價值[1-4]。

本研究以散沫花葉為原料，采用55% 的乙醇回流提取其抗氧化活性物質(zhì)，然后測定總黃酮及多酚的含量，采用常用的4種體外抗氧化體系，測定提取物對DPPH、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除能力和還原力等抗氧化活性指標。結(jié)果表明，散沫花葉提取物總黃酮及多酚含量分別為：39.42 mg/g、 116.20 mg/g ，具有較強的抗氧化活性，可能是一個有價值的生物活性資源。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

T6紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);恒溫水浴鍋、分析天平(METTLER)、離心沉淀機(上海手術(shù)器材廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠)。

沒食子酸、蘆丁均購于中國生物制品檢定研究院，批號110831-201303、100080-201202。

抗壞血酸(即Vc)，三氯化鋁、福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑、無水碳酸鈉、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、過氧化氫、鄰苯三酚(焦性沒食子酸)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、三氯乙酸、磷酸二氫鈉 、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀為市售分析純。

0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液:準確稱取DPPH固體粉末0.049 5 g，在燒杯中用少量甲醇溶解，定容至250 mL容量瓶中，配制成0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液。

10 mmol/L硫酸亞鐵溶液：精密稱取0.347 5 g硫酸亞鐵，溶于250 mL蒸餾水中，即得10 mmol/L硫酸亞鐵溶液。

10 mmol/L水楊酸乙醇溶液：精密稱取0.417 5 g水楊酸，溶于250 mL乙醇中，即得10 mmol/L水楊酸乙醇溶液。

2.5 mmol/L H2O2溶液：精密量取0.13 mL H2O2溶液(體積分數(shù)為30%)，加蒸餾水稀釋，并定容至500 mL,即得2.5 mmol/L H2O2溶液。

0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)的配制：精密稱取1.211 g 三羥甲基氨基甲烷(Tris),溶于蒸餾水中定容至100 mL；量取50.00 mL上述溶液與0.1 mol/L鹽酸22.90 mL混勻后，加水稀釋至100 mL，所得緩沖液pH值為8.2。

鹽酸溶液的配制：精密量取0.8 mL的濃鹽酸，加蒸餾水稀釋至100 mL,即得0.1 mol/L鹽酸溶液；精密量取0.85 mL濃鹽酸，加水稀釋至1 000 mL，即得10 mmol/L鹽酸溶液。

25 mmol/L鄰苯三酚溶液的配制：精密稱取0.3150 g 鄰苯三酚，用10 mmol/L鹽酸溶解，定容至100 mL，即得25 mmol/L鄰苯三酚溶液。

pH6.6磷酸緩沖液的配制：分別精密稱取磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和氯化鈉1.740 0 g、2.700 0 g、1.700 0 g，溶于400 mL蒸餾水中，即得pH6.6磷酸緩沖液。

1%鐵氰化鉀溶液的配制：精密稱取1.000 0 g鐵氰化鉀，溶于100 mL蒸餾水中，即得1%鐵氰化鉀溶液。

10%三氯乙酸溶液的配制：精密稱取10.000 0 g三氯乙酸，溶于100 mL蒸餾水中，即得10%三氯乙酸溶液。

0.1%三氯化鐵溶液的配制：精密稱取0.170 0 g六水合氯化鐵，溶于100 mL蒸餾水中，即得0.1%三氯化鐵溶液。

散沫花的葉于2013年4月采自江蘇，晾干，經(jīng)鑒定其基原為LawsoniainermisLinn.。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物的制備

稱取50 g已粉碎的散沫花的葉，加入55% 乙醇750 mL，回流提取2 h，過濾，濾渣加入55% 乙醇600 mL混勻，再次回流提取2 h，過濾，合并兩次濾液，70 ℃減壓蒸干，備用。

1.2.2 總黃酮、多酚含量測定[5-6]

1.2.2.1 總黃酮標準曲線的繪制 精密稱定0.042 01 g蘆丁，用甲醇溶解定容至10 mL，得4.201 mg/mL蘆丁標準溶液。分別移取0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mL到10 mL具塞試管中，加入1% AlCl3溶液5.00 mL，混勻，室溫靜置30 min，于435 nm處測定吸光度值，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，求線性回歸方程。

1.2.2.2 多酚標準曲線的繪制 精密稱定0.100 1 g沒食子酸，用蒸餾水溶解定容至100 mL，得1.001 mg/mL沒食子酸標準溶液。分別移取0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL至50 mL容量瓶中，加入25 mL蒸餾水，加入2.00 mL Folin-Ciocalteu試劑搖勻，靜置4～5 min，加入10% Na2CO3溶液4.00 mL，用蒸餾水定容至50 mL，置于25 ℃的恒溫水浴鍋中顯色2 h，于最大吸收波長765 nm處測定各個標準溶液吸光度，以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐，標繪制標準曲線，求線性回歸方程。

1.2.2.3 散沫花提取物總黃酮、多酚測定 準確稱取散沫花葉提取物0.100 0 g，溶于100 mL 65%乙醇中，得1.000 mg/mL樣品液，準確吸取0.10 mL提取液按1.2.2.1、1.2.2.2進行顯色反應，按照回歸方程計算測定液中總黃酮、多酚濃度，并計算出提取物中總黃酮、多酚的含量。

1.2.3 散沫花葉提取物抗氧化活性測定

準確稱取散沫花葉提取物和對照品各0.100 0 g，溶于100 mL 65% 乙醇中，得1.000 mg/mL母液，并分別稀釋，配制成0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL的提取物及對照品溶液，供抗氧化活性測定用。

1.2.3.1 對DPPH自由基清除活性的測定[7]分別移取不同濃度的樣品及對照品溶液各2.00 mL，加入0.5 mM DPPH甲醇溶液2.00 mL，混勻15 s后，放置30 min，以2 .00 mL不同濃度樣品或?qū)φ掌啡芤杭尤?.00 mL甲醇為參比，于517 nm測吸光度，記為A1，每個試樣作三次平行測定，取其均值，同時移取2.00 mL 65% 乙醇加入2.00 mL 0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液，混勻15 s后，放置30 min，以2.00 mL 65% 乙醇加入2.00 mL甲醇為參比，于517 nm測吸光度，記為A0，并根據(jù)下述公式計算清除率。

1.2.3.2 對羥自由基清除活性的測定 采用改良的Smirnoff水楊酸法[8]，即利用H2O2與Fe2+反應產(chǎn)生羥自由基，即：H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。

樣品溶液的測定：分別準確量取10 mmol/L硫酸亞鐵溶液、10 mmol/L水楊酸乙醇溶液和不同濃度的樣品溶液各1.00 mL，置于具塞試管中混勻，分別加入2.5 mmol/L H2O2溶液2.00 mL， 37 ℃水浴30 min后，分別在510 nm處測定吸光度值。每個試樣作3次平行測定，取其均值為A1，另外參照上述操作分別測定相應的吸光度值A(chǔ)0和A2，按下式計算羥自由基清除率：

其中：A0為反應體系中不含樣品，即以1mL 65%乙醇代替樣品的吸光度值；A1為反應體系中含有樣品的吸光度值；A2為反應體系中含有樣品,但以2.00 mL蒸餾水代替H2O2的吸光度值。

1.2.3.3 對超氧陰離子自由基清除活性的測定 采用鄰苯三酚自氧化法測定樣品對超氧陰離子自由基的清除能力[9]。

樣品溶液的測定：精密量取0.05 mmol/L Tris-HCL緩沖液4.50 mL，25 ℃水浴20 min，分別加入1.00 mL不同濃度的各樣品溶液和25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.40 mL,混勻，于25 ℃水浴中反應5 min，加入10 mmol/L鹽酸溶液1.00 mL終止反應，于325 nm處測定吸光度。每個試樣作3次平行測定，取其均值為A1。另外參照上述操作分別測定相應的吸光度值A(chǔ)0和A2，按下式計算超氧陰離子清除率：

其中：A0為反應體系中不含樣品，但含鄰苯三酚的吸光度值；A1為反應體系中既含樣品，又含鄰苯三酚的吸光度值；A2為反應體系中含有樣品，但不含鄰苯三酚的吸光度值。

1.2.3.4 散沫花提取物還原力的測定 參考Oyaizu和Amarowicz等的方法，稍作改進[10]。

樣品溶液的測定：

精密量取不同濃度的樣品溶液2.50 mL于試管中，依次加入2.50 mL磷酸緩沖液(pH值為6.6)和1% 鐵氰化鉀溶液2.50 mL，于50 ℃水浴保溫20 min，快速冷卻，再加入10% 三氯乙酸2.50 mL，以3000 r/min離心10 min，取上清液2.50 mL，依次加入2.00 mL蒸餾水， 0.1% 的三氯化鐵溶液0.50 mL，充分混勻，靜置10 min后，于700 nm處測吸光度值，吸光值越大表示還原力越強(以蒸餾水作對比)。每個試樣作3次平行測定，取其平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 散沫花乙醇提取物的提取率、總黃酮及多酚含量

從表1中可以看出，散沫花乙醇提取物的得率為33.26%，通過應用總黃酮線性回歸方程：y=19.17x-0.503 3(R2=0.993 3)及多酚線性回歸方程：y=0.108 5x-0.027 9(R2=0.995 5)，計算出散沫花醇提取物中的總黃酮含量(以蘆丁計)及多酚含量(以沒食子酸計)，見表1。

表1 散沫花乙醇提取率和總黃酮、多酚含量

2.2 散沫花提取物抗氧化活性比較

2.2.1 對DPPH自由基清除活性的測定結(jié)果

DPPH法自1958年被提出后，廣泛地用于各種生物試樣和食品的抗氧化能力測定。DPPH是一種比較穩(wěn)定的脂性自由基，其N上有一個游離電子，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有最大的吸收峰。加入抗氧化劑以后，DPPH捕捉一個電子與游離電子配對，紫色褪去，在517 nm處的吸收變?nèi)?，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系。依此原理用分光光度計檢測DPPH自由基與樣品液反應后吸光值的變化，可測定樣品提供氫原子、清除自由基抗氧化的能力。

圖1 散沫花提取物對DPPH清除活性

散沫花乙醇提取物對DPPH清除率的分析如圖1所示，在此實驗中，以Vc為對照，在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，Vc及樣品對DPPH自由基的清除率都呈現(xiàn)增長的趨勢，且 Vc對DPPH清除能力大于散沫花提取物。當濃度達到1.00 mg/mL時，Vc對DPPH自由基的清除率高達98.03%，散沫花提取物對DPPH自由基也具有較好的清除能力，清除率為90.63%。

2.2.2 對超氧陰離子自由基清除活性的測定結(jié)果

超氧陰離子是由氧分子接收一個電子而形成的，同生物體內(nèi)其它活性氧自由基的產(chǎn)生有密切聯(lián)系。超氧陰離子在生物體內(nèi)可長時間攻擊靶向目標，破壞細胞DNA，損傷人類機體功能?？捎糜谀M細胞內(nèi)產(chǎn)生及清除的體系有很多，但較為常用的是鄰苯三酚法。利用鄰苯三酚在堿性環(huán)境中發(fā)生自氧化鏈式反應并釋放出大量的超氧陰離子，超氧陰離子又進一步加速鄰苯三酚的氧化，生成一系列在可見光區(qū)有特征吸收的中間產(chǎn)物。而若在反應體系中加入抗氧化物質(zhì)可降低鄰苯三酚的自氧化速率，清除產(chǎn)生的超氧陰離子，抑制中間產(chǎn)物的生成，使反應溶液在325 nm處的吸光度減小。通過比較實驗組與空白組鄰苯三酚的自氧化速率評價樣品的抗氧化能力。

以Vc為對照，測定散沫花提取物清除超氧陰離子的能力，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，在試驗所測定濃度范圍內(nèi)，各樣品對超氧陰離子自由基的清除率都隨著濃度的升高而升高,總的趨勢為Vc對超氧陰離子清除能力高于散沫花提取物。在濃度達到0.75 mg/mL時，Vc對超氧陰離子自由基的清除率已經(jīng)達到100%，散沫花醇提取物對超氧陰離子自由基的清除率雖然有所升高，但趨勢較為緩慢，在1.00 mg/mL的濃度時，其抑制率不到50%，因此散沫花醇提物對超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，但是較弱。

圖2 散沫花提取物對超氧陰離子自由基的清除活性

2.2.3 散沫花醇提取物對羥自由基清除活性的測定

人體在生命活動氧化代謝過程中會產(chǎn)生各種各樣的自由基，而羥自由基能夠和多肽、蛋白、脂類、DNA，特別是鳥嘌呤核苷等發(fā)生反應，使得不飽和脂肪酸氧化，生成脂質(zhì)過氧化物，導致膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而使機體受到損傷與破壞，加快機體的衰老，引起腦缺血、帕金森氏癥、風濕性關(guān)節(jié)炎、呼吸窘迫綜合癥、心血管疾病和癌癥等疾病，是化學性質(zhì)最活潑、對機體危害最大的自由基。本試驗采用水楊酸法測定樣品對羥自由基的清除能力，水楊酸是最常用的捕獲劑，其羥基化產(chǎn)物是2,3-以及2,5-二羥基苯甲酸。過氧化氫和硫酸亞鐵溶液中的二價鐵離子發(fā)生Fenton反應產(chǎn)生羥自由基，用水楊酸捕捉高活性的羥自由基可產(chǎn)生有色物質(zhì)，且該有色物質(zhì)在510 nm處有最大吸收，若向反應體系里加入抗氧化劑，可以和水楊酸形成競爭從而減少有色物質(zhì)生成。因此本試驗通過分光光度計對有色物質(zhì)的吸光度進行測定達到間接測定自由基的目的，進而反應氧化應激水平。

圖3 散沫花提取物對羥自由基的清除活性

從圖3可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，Vc對羥自由基的清除率上升較快，散沫花提取物對羥自由基的清除率有緩慢的升高。當濃度在0.1 mg/mL左右時，散沫花提取物的清除能力均高于Vc；當濃度達到0.25 mg/mL時，散沫花提取物對羥自由基的清除率達到59.13%，稍高于Vc(清除率為58.14%)；當濃度達到1 mg/mL時，散沫花提取物對羥自由基清除率達到83.62%，具有較強的清除作用。

2.2.4 還原力測定

一種物質(zhì)的還原能力可以在一定程度上反應它潛在的抗氧化活性，通過給自由基提供電子而自身得到一個質(zhì)子，使自由基失活。通常來說，物質(zhì)的還原力越強，就表示其抗氧化活性越強。還原力測定的實質(zhì)就是檢測待測樣品能否成為好的電子供應者。本試驗以普魯士藍的生成作為檢測指標，待測樣品將Fe3+/鐵氰化物還原為Fe2+/鐵氰化物，反應體系溶液變?yōu)椴煌潭鹊乃{色，其在700 nm處有特征光吸收，吸光度大小反應待測樣品的抗氧化活性。

圖4 散沫花提取物還原力測定

由圖4可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)， Vc還原力隨著濃度的增加而明顯增大，在濃度為0.25 mg/mL時，其還原能力達到1.4；散沫花提取物的還原力與濃度存在量效關(guān)系，但還原能力一般，在濃度為1 mg/mL時，還原力為2.395，稍弱于Vc。

3 結(jié) 論

3.1 采用55%乙醇回流提取散沫花中的活性物質(zhì)，提取率為33.26%，提取物中總黃酮的含量為39.42 mg/g，多酚的含量為116.20 mg/g。用同法提取了另外一種染指甲的鳳仙科植物鳳仙花((ImpatiensbalsaminaL.)的葉、花，提取物中總黃酮含量為112.13、108.06 mg/g，多酚含量為72.81、66.07 mg/g。散沫花與鳳仙花的原植物科屬不同，前者屬于千屈菜科，后者屬于鳳仙花科。其藥用部位也不同，前者用其葉，后者用其花。實驗表明鳳仙花的葉及花中的總黃酮約是散沫花葉的3倍，而散沫花葉所含的多酚類物質(zhì)約是鳳仙花葉及花的2倍，說明二者的化學物質(zhì)基礎(chǔ)具有一定的差別，在實際應用要注意區(qū)分。

3.2 目前，沒有一種普遍通用的方法就能較為準確地定量測定某樣品的抗氧化能力，因此在評價某樣品抗氧化活性時，通常采用幾種不同的檢測方法。本文采用了DPPH自由基清除能力測定、羥自由基清除能力測定、超氧陰離子清除能力測定和還原能力測定，以Vc為對照，結(jié)果表明，散沫花提取物均有不同程度的抗氧化活性，且抗氧化能力與濃度呈量效關(guān)系；綜合各個檢測方法，散沫花提取物具有較強的清除DPPH、羥自由基清除活性和還原力，且與對照組Vc相近，都有劑量依賴性。

3.3 樣品的抗氧化活性與總黃酮、多酚含量之間存在一定的相關(guān)性。雖然未對其相關(guān)性作定量測定，但實驗結(jié)果表明，散沫花提取物的抗氧化活性與多酚含量更為密切。

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Determination of Total Flavonoids and Phenolic Contentand Antioxidant Activities of Ethanol Extract from theLeaves ofLawsoniainermisLinn.

Jiang Hongfang1,2, Shi Baojun1, Zhang Fenglun1, Chen Lei1, Shi Guoxin2*, Zhang Weiming1,2*

(1.Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042, China; 2.Life Science Institute of Nanjing Normal University, Nanjing 210046， China)

The aim of this study was to investigate the contents of total flavonoid and phenolic, and antioxidant activity of 55% ethanolic extract from the leaves ofLawsoniainermisLinn.. The results revealed that the total flavonoid and phenolic contents of the extract were 39.42 mg/g Rutin extract and 116.20 mg/g Galic acid extract.Leaf extracts exhibited the highest activity in removing DPPH free radicals,hydroxyl free radicals and superoxide anion as well as the highest reducing capacity.From these results, the extract fromL.inermismight be a valuable bioactive resource.

LawsoniainermisLinn; flavonoid; phenolic; antioxidant activity

2015-02-21

國家“十二五”科技支撐計劃(2012BAD36B01)。

姜洪芳(1974—),女,博士研究生,副研究員,主要研究天然產(chǎn)物活性物質(zhì)應用與開發(fā)。E-mail:jhf74@163.com

*通訊作者： 張衛(wèi)明,男,研究員,從事植物活性物質(zhì)的應用與開發(fā)。E-mail: botanyzh@163.com 施國新,男,教授,從事重金屬對植物生理生化影響研究。E-mail:gxsh@njnu.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.05.003

R284

A

1006-9690(2015)05-0009-05