親和溫敏聚合物PNIPAA，—co—AA，的制備及表征

李樹白

摘 要：制備一種新型的蛋白質(zhì)分離純化材料。探討親和溫敏雙水相體系對(duì)牛血清白蛋白（BSA）的分配特性。優(yōu)化分離純化BSA條件，同時(shí)測(cè)定BSA的回收率以及純化倍數(shù)，并通過電泳SDS-PAGE對(duì)BSA蛋白進(jìn)行了表征。

關(guān)鍵詞：親和溫敏聚合物 牛血清白蛋白（BSA） 分配系數(shù) 電泳

中圖分類號(hào)：O645.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2014）12（b）-0072-02

雙水相萃取技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于生物化學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，可用來(lái)分離蛋白質(zhì)、酶、病毒、脊髓病毒和線病毒的純化、核酸、DNA的分離、干擾素、細(xì)胞組織、抗生素、多糖、色素、抗體等。雙水相萃取技術(shù)作為一種新型的分離技術(shù)，可以利用不復(fù)雜的設(shè)備、并在溫和條件下進(jìn)行簡(jiǎn)單的操作就可獲得較高收率和有效成分，克服了常規(guī)萃取有機(jī)溶劑對(duì)生物物質(zhì)的變性作用，在萃取過程中保持生物物質(zhì)的活性及構(gòu)象等明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。該文以金屬離子為配基的親和溫敏聚合物作為雙水相體系的成相物質(zhì)來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化，探討了對(duì)牛血清白蛋白（BSA）的分配特性，優(yōu)化分離純化BSA的條件，同時(shí)測(cè)定回收率和純化倍數(shù)，并通過SDS-PAGE對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行了表征。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 雙水相體系的構(gòu)建

親和溫敏聚合物PNIPAA，-co-AA，-Cu為自制。將PNIPAA，-co-AA，-Cu與無(wú)機(jī)鹽溶液混合時(shí)，離子強(qiáng)度會(huì)不斷增加，而使PNIPAA，-co-AA，-Cu分子內(nèi)部以及PNIPAA，-co-AA，-Cu分子之間的疏水作用增強(qiáng)，導(dǎo)致PNIPAA，-co-AA，-Cu不能與之形成雙水相體系而直接以絮凝沉降的方式形成相分離，因此選擇了親和溫敏聚合物-葡聚糖-40 000雙水相體系作為研究對(duì)象。

1.2 雙水相體系的萃取原理

當(dāng)萃取體系的性質(zhì)不同時(shí)，物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力（如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等）的存在和環(huán)境因素的影響，使其在上、下相中的濃度不同：其分配行為可由分配系數(shù)K（K=Ct/Cb，Ct、Cb分別為上相和下相分配物質(zhì)的濃度，單位為g/L）來(lái)描述。分配系數(shù)K等于物質(zhì)在兩相的濃度比，由于各種物質(zhì)的K值不同，可利用雙水相萃取體系對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離。其分配情況服從分配定律，即，“在一定溫度一定壓強(qiáng)下，如果一個(gè)物質(zhì)溶解在兩個(gè)同時(shí)存在的互不相溶的液體里，達(dá)到平衡后，該物質(zhì)在兩相中濃度比等于常數(shù)”，分離效果由分配系數(shù)來(lái)表征。該文中，利用親和溫敏聚合物PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖4萬(wàn)形成的雙水相體系分離純化BSA的研究中，可以通過兩相中單位體積BSA的蛋白質(zhì)含量的比值表示BSA的分配系數(shù)，繼而計(jì)算得到BSA的回收率。

1.3 雙水相體系相圖的繪制

親和溫敏聚合物PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖-40 000組成兩相聚合物，并配置一定濃度的母液。PNIPAA，-co-AA，-Cu母液精確稱量后加入試管中，加入葡聚糖40 000母液搖混均勻，直至出現(xiàn)混濁，計(jì)量葡聚糖40 00母液加入量，計(jì)算各自母液濃度，加水溶解至恰好澄清，計(jì)算水的加入量。繼續(xù)加入葡聚糖40 000母液，再次變得渾濁，如此反復(fù)，得到恰好混濁時(shí)PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖40 000在體系中的濃度含量，繪出PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖40 000的雙線相圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系相圖的繪制結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)可知，由PNIPAA，-co-AA，-Cu/葡聚糖40 000構(gòu)成的雙水相體系中，上相為親和溫敏聚合物富集相，下相為葡聚糖40 000富集相。如圖1雙水相相圖所示PNIPAA，-co-AA，-Cu/葡聚糖40 000雙水相相圖符合一般高聚物/高聚物相圖的規(guī)律，正是基于聚合物的不相容性。PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖40 000分子之間存在空間阻礙作用，無(wú)法相互滲透，不能形成均勻的一相，因此PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖40 000具有相互分離的傾向，故而在一定的條件和濃度下即可分離成兩相。在PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖40 000雙水相體系中，雙節(jié)線以下的區(qū)域?yàn)榫鄥^(qū)，以上的區(qū)域?yàn)閮上鄥^(qū)，在曲線的上方區(qū)域中，任何葡聚糖4萬(wàn)與PNIPAA，-co-AA，-Cu相對(duì)應(yīng)的含量進(jìn)行試驗(yàn)，雙水相體系形成。

2.2 葡聚糖4萬(wàn)濃度對(duì)BSA分配系數(shù)及回收率的影響

由表1可知，BSA的分配系數(shù)隨著葡聚糖40 000濃度的提高而不斷減小，說明隨著雙水相體系中葡聚糖40 000濃度增加，BSA不斷從PNIPAA，-co-AA，-Cu富集相（即上相）中向葡聚糖40 000富集相（即下相）分配，同樣上相中BSA的回收率也下降。由表1可知，，隨著葡聚糖40 000濃度從6%增加至14%，BSA的分配系數(shù)從22.92下降到了3.97。同樣，BSA的回收率也從80.4%下降到了48.2%。由于從葡聚糖40 000溶液中分離純化得到BSA的難度增加，并且隨著葡聚糖40 000濃度的增加，體系的粘度也不斷升高，眾所周知，高粘度體系不利于目標(biāo)分配物質(zhì)的相間傳質(zhì)過程，會(huì)影響目標(biāo)分離物質(zhì)的分配系數(shù)。因此考慮到要降低體系的粘度和節(jié)省物料以及提高BSA的分配系數(shù)，選擇了葡聚糖40 000濃度為6.0%（w/w）作為雙水相的最優(yōu)下相濃度。

2.3 胎牛血清中BSA的分離純化

圖2是蛋白質(zhì)SDS-PAGE后的雙水相系統(tǒng)溫度敏感的親和純化的分析結(jié)果，66 kDa的蛋白質(zhì)的分子量，胎牛血清的電泳圖顯示該頻帶很寬，估計(jì)含有更多的雜質(zhì)，另外還有蛋白污染帶。雙水相系統(tǒng)純化后的蛋白條帶，由于BSA顏色加深的相位特性，沒有雜蛋白條帶，表明親和力和溫度敏感的雙水相系統(tǒng)可有效地用于富集和分離BSA。

3 結(jié)語(yǔ)

PNIPAA，-co-AA，-Cu/葡聚糖40000所構(gòu)成的雙水相體系中，上相為PNIPAA，-co-AA，-Cu富集相，下相為葡聚糖40 000富集相。通過實(shí)驗(yàn)繪制出了雙水相的相圖；BSA經(jīng)過PNIPAA，-co-AA，-Cu/葡聚糖40 000構(gòu)成的雙水相體系純化后，上相中得到的BSA蛋白的特征譜帶顏色加深，而其雜質(zhì)蛋白明顯變淡，而下相中幾乎不含有BSA分子的譜帶，表明該親和溫敏雙水相體系能有效用于BSA的富集和分離。

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