消化道菌群及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

劉建釵，劉彥威，白福娟，劉 月

（河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北省禽病工程研究中心，河北邯鄲056021）

消化道微生物種類多、數(shù)量大，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，被認(rèn)為是體外“器官”［1］。消化道微生態(tài)菌群質(zhì)和量與動(dòng)物品種、個(gè)體及消化部位有關(guān)，同時(shí)受年齡、飲食和健康狀況影響。微生物與宿主之間互相作用、互相依賴，共同形成的一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)消化道起到重要的調(diào)節(jié)作用［2-3］。長(zhǎng)期以來，研究消化道菌群一直依靠細(xì)菌培養(yǎng)，由于消化道細(xì)菌絕大部分不能用現(xiàn)有的培養(yǎng)方法獲得。近年來，隨分子生物學(xué)的發(fā)展，建立許多新的方法，使得深入而全面的了解微生物群落結(jié)構(gòu)、完善微生物的分類鑒定系統(tǒng)成為可能。

1 消化道菌群的作用

消化道微生物是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的組成部分。消化道原藉微生物通過種間競(jìng)爭(zhēng)，有效地消除腸道病原微生物，不僅是抗感染重要原因，還能阻止病原微生物致癌酶的作用，消除有害化合物的合成。腸道生態(tài)系統(tǒng)參與消化酶和維生素的合成，營(yíng)養(yǎng)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生短鏈脂肪酸和聚酰胺，或增強(qiáng)黏蛋白的合成能力，維持腸上皮細(xì)胞完整性。與上層的黏液，共同形成一道重要屏障，防止微生物侵入或過敏原吸收。腸道細(xì)菌影響胃腸道免疫功能，通過原位微生物調(diào)節(jié)，促進(jìn)對(duì)抗原更快和更有效的免疫應(yīng)答。腸道微生物維持健康狀態(tài)必不可少的，固有菌群失調(diào)被認(rèn)為是許多的疾病的原因。在生態(tài)系統(tǒng)中，菌群質(zhì)和量破壞會(huì)降低免疫功能，增加真菌定植風(fēng)險(xiǎn)和胃-腸道紊亂。通常認(rèn)為異常菌群是腸道疾病炎癥性的原因。因此，腸道微生物復(fù)合體作為一個(gè)整體，其鑒定方法引起越來越多的興趣，對(duì)胃腸道中的菌群定性和定量分析，為全面了解腸道微生物在體內(nèi)各要素間的相互作用，對(duì)了解許多疾病的根源是必要的，也有助于開發(fā)新的療法［4-6］。

2 消化道微生物種類和分布

消化道中存在著數(shù)量龐大的微生物，這群微生物依靠人和動(dòng)物消化道生活，同時(shí)幫助寄主完成多種生理生化功能。消化道微生物涉及17科50屬1 000多種細(xì)菌，細(xì)胞總數(shù)量達(dá)100萬億，這個(gè)數(shù)目相當(dāng)于10倍的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的數(shù)目［3］。對(duì)消化道菌群有明顯影響的因素包括分娩、飼養(yǎng)方式、飼喂、藥物、應(yīng)激及侵入性細(xì)菌的治療等。微生物的質(zhì)和量隨生長(zhǎng)過程改變而變化。在分娩時(shí)，胎兒定植的微生物來自母體生殖道和產(chǎn)房微環(huán)境。發(fā)現(xiàn)母乳喂養(yǎng)的嬰兒雙歧桿菌和擬桿菌的細(xì)菌百分比特別高，而牛奶喂養(yǎng)促進(jìn)大腸埃希菌和梭狀芽胞桿菌的生長(zhǎng)。一個(gè)人比較成熟的腸道微生態(tài)是建立需要3年左右，7年最具典型。以后隨年齡增長(zhǎng)，擬桿菌和雙歧桿顯著降低，而梭狀芽胞桿菌、桿菌和梭桿菌明顯增加，后者能夠產(chǎn)生潛在的致癌物質(zhì)［7］。

每段消化道內(nèi)均有微生物分布，但其種類是不同的，主要是兼性好氧菌或兼性厭氧菌。口腔和咽部有大量不同的氧需細(xì)菌群，在舌后咽壁基部黏滑羅斯菌最多，鏈球菌定植牙菌斑。食道和胃的微生物隨著吞咽食物不同而異。在腸道99%是厭氧菌。胃pH低，不利于大多數(shù)細(xì)菌的繁殖，胃是微生物定植較低的器官（＜103個(gè)／mL胃內(nèi)容物），其微生物大多數(shù)為厭氧菌（葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬和乳桿菌屬），嚴(yán)格厭氧微生物通常是零星存在的。在小腸內(nèi)細(xì)菌數(shù)量增加，小腸起始段定植環(huán)境與胃差異不大；小腸后段生態(tài)環(huán)境與結(jié)腸類似，微生物的數(shù)量為106CFU／g～107CFU／g糞便，大多是厭氧菌（梭狀芽胞桿菌屬、雙歧桿菌屬等）。大腸蠕動(dòng)緩慢，pH接近中性，適于大多數(shù)細(xì)菌環(huán)境，大腸菌群數(shù)量大、種類多（10CFU／g～10CFU／g糞便），具有特殊兼性和專性厭氧細(xì)菌。優(yōu)勢(shì)菌群（約占總數(shù)30%～40%）包括擬桿菌、雙歧桿菌和梭狀芽胞桿菌，次優(yōu)勢(shì)菌為腸球菌、大腸埃希菌和乳酸桿菌。其他大腸微生物在動(dòng)物個(gè)體之間存在差異，有宿主特異性［7-8］。

研究發(fā)現(xiàn)消化道菌群在消化腔的分布不同。乳桿菌緊靠黏膜分布，黏附在上皮形成細(xì)菌生物膜；大腸埃希菌、腸球菌等好氧菌和兼性好氧菌貼近腸腔分布，與腸腔菌群沒有明顯差異；在兩者之間分布糞桿菌、消化鏈球菌和優(yōu)桿菌等厭氧菌［7，9］。

3 腸道細(xì)菌的檢測(cè)方法

3.1 傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法

用傳統(tǒng)方法在培養(yǎng)基上可獲得單菌落。有些培養(yǎng)基還可用于分離、計(jì)數(shù)和鑒定。在培養(yǎng)基添加某些物質(zhì)，可顯示鑒定意義特征。例如，大腸埃希菌代謝產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶，產(chǎn)生特異顏色菌落，只需數(shù)小時(shí)就可鑒定。為了解細(xì)菌對(duì)宿主的影響，也需要進(jìn)行微生物培養(yǎng)，但現(xiàn)有培養(yǎng)基無法滿足特殊微生物需要，一種解決方案就是衛(wèi)星培養(yǎng)。如流感嗜血桿菌與金黃色葡萄球菌一起培養(yǎng)，葡萄球菌能合成Ⅴ因子釋放于培養(yǎng)基中，從而促進(jìn)流感嗜血桿菌的生長(zhǎng)。盡管這樣，腸道內(nèi)92.70%微生物無法培養(yǎng)（腸道菌有1 822種，其中1 689種為不可培養(yǎng)細(xì)菌）［7-8］，主要是無法提供合適培養(yǎng)環(huán)境（包括溫度、pH、滲透壓和氧含量等）。常規(guī)培養(yǎng)不可能對(duì)腸道生態(tài)系統(tǒng)全面分析，需要進(jìn)行新研究方法的探索。

3.2 變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等于20世紀(jì)80年代初期發(fā)明的，起初主要用來檢測(cè)DNA片段中的點(diǎn)突變。一般凝膠電泳，遷移決定于分子大小和電荷，能夠把不同長(zhǎng)度DNA片段區(qū)分開，但不能區(qū)分相同長(zhǎng)度DNA片段。DGGE是在一般凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺），從而能夠把相同長(zhǎng)度，但序列不同的DNA片段區(qū)分開。Muyzer等［10］1993年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究。后來又發(fā)展出其衍生技術(shù)，溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。此后10年間，該技術(shù)被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，目前已經(jīng)發(fā)展為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要方法之一，已用于人、豬、牛、雞、鼠和狗等胃腸道微生物多樣性研究。Simpson J M 等［11］首次用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳分析豬腸道微生物，發(fā)現(xiàn)不同年齡豬和不同個(gè)體間腸道細(xì)菌種群存在差異。Kocherginskaya S A 等［12］則率先研究了瘤胃細(xì)菌的結(jié)構(gòu)。Lan P T等［13］應(yīng)用16SrDNA序列分析，對(duì)雞盲腸中存在的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定。用同樣的方法，張恒業(yè)等對(duì)斷奶幼兔的腸道細(xì)菌定植情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)微生態(tài)制劑改善腸道菌群定植。程翔等［14］發(fā)現(xiàn)在奶牛飼糧添加芽胞桿菌、乳酸菌、酵母菌等益生菌，使腸道菌群多樣性明顯高于對(duì)照組，證實(shí)微生態(tài)制劑具有調(diào)節(jié)奶牛腸道菌群平衡的作用。DGGE具有檢測(cè)速度快、重復(fù)性好、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，其局限是敏感性，只能檢測(cè)到1%的微生物菌落，會(huì)忽略數(shù)量少、但功能重要的細(xì)菌。

3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）技術(shù)是由Applied Biosystems公司于1996年首先推出的，它的原理是將合適的熒光基團(tuán)加入PCR反應(yīng)體系中，根據(jù)熒光信號(hào)的積累來對(duì)PCR的進(jìn)程實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，未知模板的定量分析通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行。近年來，real-time PCR已開始用于腸道微生態(tài)菌群分析［15］。Matsuki T 等［16］通 過 realtime PCR研究了腸雙歧桿菌分布，發(fā)現(xiàn)青春雙歧桿菌（B.adolescentis）、鏈狀雙歧桿菌（B.catenulatum）和長(zhǎng)鏈雙歧桿菌（B.longum）是主要雙歧桿菌。Ereqat S等［17］基于目的基因設(shè)計(jì)了特異性引物，結(jié)合real-time PCR細(xì)菌可被鑒定到不同株的水平。丁俊榮等［18］采用real-time PCR方法，對(duì)腸道脫硫弧菌的數(shù)量進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，其中息肉（2.9×106CFU／mL）和潰瘍性結(jié)腸炎（1.2×106CFU／mL）人群腸道中脫硫弧菌的數(shù)量明顯高于健康人群（6.8×105CFU／mL）。黃怡等［19］研究了新生仔豬口服屎腸球菌對(duì)其腸道菌群組成的影響，發(fā)現(xiàn)口服屎腸球菌改善哺乳期仔豬腸道菌群組成，促進(jìn)腸道健康。易園驪等［20對(duì)腸道內(nèi)菌群進(jìn)行了real-time PCR研究，在兔的糞便中細(xì)菌數(shù)量分別為大腸埃希菌（11.48±1.09）拷貝數(shù)／克濕糞、乳酸桿菌（4.94±0.95）拷貝數(shù)／克濕糞、雙歧桿菌屬（4.07±0.97）拷貝數(shù)／克濕糞，且大腸埃希菌數(shù)量與非酒精性脂肪性肝病有關(guān)。王曉霞等［21］用real-time PCR研究無患子皂甙粉對(duì)瘤胃微生態(tài)影響，發(fā)現(xiàn)無患子皂甙粉顯著降低了產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量，顯著提高了溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量。與常規(guī)的PCR技術(shù)相比，real-time PCR技術(shù)具有較高的靈敏性和特異性，定量較準(zhǔn)確，重復(fù)性好，污染少，自動(dòng)化程度較高等特點(diǎn)，但是定量也有其缺點(diǎn)，如不能檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，需要摸索優(yōu)化的條件等。

3.4 熒光原位雜交技術(shù)

熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）將帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針直接與固定在載玻片上的細(xì)胞進(jìn)行雜交，固定過程中要使短的探針滲透到細(xì)胞內(nèi)的核酸，用熒光顯微鏡即可觀察到帶有雜交熒光標(biāo)記探針的細(xì)胞。目前FISH技術(shù)在環(huán)境樣品中微生物多樣性，污水處理相關(guān)微生物多樣性，內(nèi)共生微生物多樣性及醫(yī)學(xué)微生物口腔、腸胃、呼吸道菌群多樣性研究中得到了廣泛的應(yīng)用。美國(guó)研究人員用寡核苷酸作探針檢測(cè)糞便中腸道菌群。Wang R F等［22］改良基于16SrRNA基因序列為探針，可檢測(cè)20種腸道菌，如大腸埃希菌、腸球菌、嗜酸乳桿菌等。采用通用引物，F(xiàn)prausnitzii等用3個(gè)40核苷酸探針，每個(gè)有針對(duì)特異性細(xì)菌，調(diào)查的結(jié)果表明，該方法能有效檢測(cè)糞便樣本中占主導(dǎo)地位的人腸內(nèi)細(xì)菌，可同時(shí)檢測(cè)幾十個(gè)菌種［2］。Jonach B等［23］用 FISH 方法，觀察了腹瀉和健康仔豬腸菌群情況，發(fā)現(xiàn)兩組豬中，大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難梭菌沒有差異，首次在腹瀉豬腸道發(fā)現(xiàn)腸球菌，推測(cè)黏附在腸黏膜的大腸埃希菌和腸球菌可能參與仔豬腹瀉發(fā)病機(jī)制。FISH技術(shù)可在顯微鏡直接觀察，周期短，能迅速得到結(jié)果，特異性好，定位準(zhǔn)確，但FISH技術(shù)的應(yīng)用要受到環(huán)境樣品微生物的生理狀態(tài)的影響，如芽胞、放線菌及休眠時(shí)期細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性降低，以及細(xì)菌在繁殖過程中熒光基因可能發(fā)生變化，從而影響群試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性［24］。

總之，目前研究腸道微生物菌群的方法分為傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和基因分析方法，這兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。分離培養(yǎng)最大的缺陷是無法檢測(cè)龐大的腸道微生物，用這種方法，只能夠檢測(cè)生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上的細(xì)菌，腸道微生物的檢測(cè)，分離培養(yǎng)仍然是基本和廣泛使用的方法。然而，整個(gè)胃腸道的微生物準(zhǔn)確的定量和定性調(diào)查，基因測(cè)試是必需的。由于基因分析不僅可以識(shí)別數(shù)量龐大的新微生物，而且確定在胃腸道不同部位的優(yōu)勢(shì)菌群。因此，這兩種技術(shù)結(jié)合將成為了解腸道細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵因素。

［1］Eckburg P B，Bik E M，Bernstein C N，et al.Diversity of the human intestinal microbial flora［J］.Science，2015，308：1635-1638.

［2］Maier E，Anderson R C，Roy N C，et al.Understanding how commensal obligate anaerobic bacteria regulate immune functions in the large intestine［J］.Nutrients，2015，7（1）：45-73.

［3］張 冉.肉質(zhì)性狀相關(guān)基因的表達(dá)及消化道菌群多樣性與動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系［D］.山東濟(jì)南：山東大學(xué)，2014：18-20.

［4］Schippa S，Conte M P.Dysbiotic events in gut microbiota：impact on human health［J］.Nutrients，2014，6（12）：5786-5805.

［5］趙 冉，孔秀娟，李 耿，等.燕窩對(duì)正常小鼠腸道菌群的影響［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（6）：86-88.

［6］李春慧，蒲萬霞，昊 潤(rùn)，等.微生態(tài)制劑應(yīng)用研究概況［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（11）：114-118.

［7］Ignys I，Szachta P，Galeckea M，et al.Methods of analysis of gut microorganism-actual state of knowledge［J］.Ann Agri Environ Med，2014，21（4）：799-803.

［8］高權(quán)新，吳天星，王進(jìn)波.腸道微生物與寄主的共生關(guān)系研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2010，22（3）：519-526.

［9］Hoope L V，Gordon J I.Commensal host-bacterial relationships in thegut［J］.Science，2001，292（1）：1115-1118.

［10］汪孟娟，曹銀生，胡艷霞，等.應(yīng)用PCR-DGGE分析肉雞呼吸道中細(xì)菌多樣性［J］.中國(guó)飼料，2013（4）：26-28.

［11］Simpson J M，Mccracken V J，White B A，et al.Application of denaturant gradient gel-electrophoresis for the analysis of the porcine gastrointestinal microbiota［J］.J Microbiol Meth，1999，36（3）：167-179.

［12］Kocherginskaya S A，Am inov R I，White B A.Analysis of the rumen bacterial diversity under two different diet conditions using denaturing gradient gel electrophoresis，random sequencing and statistical ecology approaches［J］.Anaerobe，2001，7：119-134.

［13］Lan P T，Hayashi H，sakamoto M.Phylogenetic analysis of cecal microbiota in chicken by the use of 16SrDNA clone libraries［J］.Microbiol Immunol，2002，46（6）：371-382.

［14］程 翔，楊景云，馬淑霞，等.變性梯度凝膠電泳技術(shù)在微生態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用的進(jìn)展［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（4）：475-481.

［15］孫麗瑩，楊云生.微生物非培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步及腸道微生態(tài)研究進(jìn)展［J］.中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2013，25（9）：573-576.

［16］Matsuvi T，Watanaae K，F(xiàn)ujimoto J，et al.Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16SrRNA-gene-targeted species-specific primers［J］.Appl Environ Microbiol，1999（10）：4506-4512.

［17］Ereqat S，Bar-Gal G K，Nasereddin A，et al.Rapid differentiation ofMycobacteriumtuberculosisandM.bovisby highresolution melt curve analysis［J］.J Clin Microbiol，2010，48：4269-4272.

［18］丁俊榮，張秋香，劉小鳴，等.江蘇無錫健康與腸病人群腸道脫硫弧菌數(shù)量及腸道菌群多樣性［J］.微生物學(xué)報(bào)，2012，52（8）：1033-1039.

［19］黃 怡，黃 琴，崔志文，等.新生仔豬口服屎腸球菌對(duì)其腸道菌群組成及化學(xué)屏障的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32（7）：1007-1010.

［20］易園驪，高鴻亮，姚 萍.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)非酒精性脂肪性肝炎新西蘭兔腸道內(nèi)菌群的變化［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（5）：548-553.

［21］王曉霞，王 佳，王 侃，等.無患子皂甙對(duì)瘤胃微生態(tài)的影響［J］.中國(guó)畜牧雜志，2013，49（13）：59-63.

［22］Wang R F，Kim S J，Robertson L H，et al.Development of a membrane-array method for the detection of human intestinal bacteria in fecal samples［J］.Mol Cell Probes，2002，16（5）：341-350.

［23］Jonach B，Boye M，Stockmarr A，et al.Fluorescence in situ hybridization investigation of potentially pathogenic bacteria involved in neonatal porcine diarrhea［J］.BMC Vet Res，2014，14（10）：68.doi：10.1186／1746-6148-10-68.

［24］吳 旭，吳中明.熒光原位雜交在腸道微生物學(xué)中的應(yīng)用［J］.國(guó)際消化病雜志，2012，32（2）：74-76.