含有Th細胞表位的合成PCV2 ORF2 Cap多肽抗原的表達及免疫原性分析

陳善真，趙 焱，李中圣，羅 均，陳克宏，王貴平，李其昌

(廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400)

含有Th細胞表位的合成PCV2 ORF2 Cap多肽抗原的表達及免疫原性分析

陳善真，趙 焱，李中圣，羅 均，陳克宏，王貴平，李其昌*

(廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400)

擬測定在PCV2 ORF2 Cap P1多肽抗原中添加從PCV2 ORF1、ORF3中篩選的Th細胞表位多肽在促進其免疫原性中的作用，以及合成表達的PCV2 ORF2 Cap P1多肽抗原作為疫苗抗原的可行性。采用生物信息學及分子生物學方法，篩選獲得1條泛宿主新型Th細胞表位多肽和3條PCV2特異的含有Th細胞抗原表位的多肽序列，然后將這4條Th細胞多肽氨基酸序列與篩選自ORF2 Cap1上的1條B細胞表位多肽序列進行串聯(lián)組合，密碼子優(yōu)化，插入酶切位點、終止密碼子，然后進行密碼子適應指數(shù)和分布頻率分析，預測可以實現(xiàn)高效表達后再進行化學合成。合成的P1多肽抗原連接到pET-30a表達載體，并轉化至BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞中，構建表達工程菌BL21(DE3)pLysS-pET-30a-P1。經(jīng)IPTG誘導表達后P1可實現(xiàn)高效表達，SDS-PAGE鑒定表達量，Western Blot鑒定其生物活性，然后分別免疫小鼠和豬，測定小鼠免疫后的抗體水平以及豬免疫后P1合成多肽抗原對外周血淋巴細胞的刺激增殖情況。結果表明，設計合成表達的PCV2 P1多肽抗原序列，密碼子適應性指數(shù)為0.89，能夠實現(xiàn)高水平表達，目的片段大小約為28.29 ku，具有良好的免疫原性；MTT試驗結果表明，P1多肽抗原免疫后機體內(nèi)IFN-γ和IL-4的表達量明顯增加，且與對照組差異顯著(P<0.05)。這說明P1能夠誘導機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫反應，為其作為疫苗用抗原的進一步研究奠定了理論基礎。

PCV2；Th細胞表位多肽；Cap蛋白

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PWMS)的重要病原，感染PCV2的豬可導致淋巴系統(tǒng)損傷和免疫缺陷，這可能是由于PWMS感染后損傷豬的T、B淋巴細胞，使單核/巨噬細胞系的細胞數(shù)目增多，并改變細胞因子的應答模式，從而引起機體抵抗力下降[1-3]。

PCV2能損傷機體細胞因子的免疫應答，患有PMWS的豬主要特征為淋巴細胞缺損和組織細胞浸潤[4]。從PCV2感染和患病豬中分離出來的外周血單核細胞，其分泌IFN-γ和記憶性T細胞的能力下降[5]，而從健康和患PMWS豬中分離到的PBMS用PHA和SEB刺激后，IL-2、IL-4的產(chǎn)量也會降低[6]。

淋巴細胞增殖試驗表明，免疫優(yōu)勢輔助T細胞反應表位始終定位于ORF1和ORF3 非結構蛋白上[7]。沒有免疫優(yōu)勢的線性Th表位定位于ORF2編碼的非結構蛋白上。這就可以解釋傳統(tǒng)的以PCV2衣殼蛋白為抗原而制備的亞單位疫苗因其Th細胞表位的稀缺而導致免疫原性的有限性。輔助性T細胞表位可以誘導保護性T輔助細胞(Th)的反應，從而發(fā)信號給B細胞產(chǎn)生抗體。因此，以合成肽作為將免疫優(yōu)勢Th表位呈現(xiàn)給免疫系統(tǒng)是影響合成肽免疫原性一個關鍵因素。

Cap蛋白是PCV2 ORF2編碼的結構蛋白，具有良好的免疫原性，免疫動物后能產(chǎn)生較好的中和抗體，從而抵御病毒感染對B細胞的損傷[8]。豬用疫苗的免疫功能，及其預防豬感染病毒的能力受多個病毒的輔助Th細胞位點的影響，本研究中設計的合成肽疫苗，與PCV2衣殼蛋白上篩選定位的B細胞表位相比，除具有免疫優(yōu)勢B細胞表位外，還增加了通用型和PCV2特異的Th細胞表位，輔助Th細胞位點與Cap蛋白B 細胞位點的交叉保護可大大提高疫苗的效力。

鑒于疫苗對防制此病的意義[9]，本研究選取ORF2的主要B細胞抗原表位，在此基礎上設計增加泛宿主新型輔助T細胞表位多肽序列，組合后進行密碼子優(yōu)化，增加其抗原性及表達量，然后借助大腸桿菌表達系統(tǒng)實現(xiàn)其表達，并通過小鼠和斷奶仔豬的免疫試驗，檢測抗體水平和刺激淋巴細胞增殖的情況來測定合成表達的PCV2合成肽抗原的免疫原性，為下一步的疫苗相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞、蛋白質Marker，預染Marker，購自TIANGEN生物；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ，購自TaRaKa生物；IPTG、卡那霉素、肝素鈉、淋巴細胞分離液、MTT、Gibco RPMI-1640培養(yǎng)液及其他常規(guī)試劑、培養(yǎng)基購自北京鼎國生物技術有限責任公司；ISA201VG佐劑，由SEPPIC公司提供；勃林格PCV2商品苗，氨基酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司進行合成。

1.2 實驗動物及分組

BALB/c小鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，試驗用斷奶仔豬，12頭，購于鶴山市某豬場，均未進行PCV2疫苗免疫，隨機分為4組，每組3頭：P1抗原免疫組、勃林格疫苗免疫組、空白佐劑免疫組和空白對照組。

1.3 重組多肽序列P1的設計

參考相關的研究[7，10]，設計篩選并合成含有泛宿主新型輔助T細胞表位的4條多肽，篩選部位來自于PCV2 ORF1、ORF3，并參考其他學者的研究[11-12]從PCV2 ORF2中篩選出1條主要的B細胞多肽抗原表位，然后利用連接性堿基將這5條多肽進行串聯(lián)，增加相應的連接性氨基酸及酶切位點，對其中的密碼子進行優(yōu)化，并測定密碼子適應指數(shù)及密碼子選擇頻率。將優(yōu)化設計完成的氨基酸序列命名為P1，P1序列含有256個氨基酸，理論相對分子質量為28.29 ku。

1.4 表達質粒的構建

表達序列設計完成后送由南京金斯瑞生物科技有限公司進行合成，并將序列經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，連接到pET-30a表達載體中，構建表達質粒，構建完成的表達質粒命名為pET-30a-P1。

1.5 P1的誘導表達

將構建完成的表達質粒連接轉化至BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞中，構建表達工程菌BL21(DE3) pLysS-pET-30a-P1。挑取單個菌落在含有0.05%卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)，待OD600 nm值達到0.6 時加入IPTG進行誘導表達，使其終濃度為1.0 mmol·L-1，誘導表達6 h后收集菌液，進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.6 P1免疫原性的Western Blot分析

應用Western Blot驗證表達多肽P1的免疫原性，方法如下：①以表達的P1為樣品，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；②轉膜，封閉；③以自制純化的PCV2豬多克隆抗體為一抗，1∶500倍稀釋后進行孵育(37 ℃，1 h)，清洗；④加1 000倍稀釋的HRP-羊抗豬IgG二抗，孵育(37 ℃ 1 h)，清洗；⑤應用DAB 顯色試劑盒進行顯色。

1.7 小鼠免疫試驗驗證P1免疫原性

將表達純化的P1按照5 μg·mL-1的濃度分別免疫8～10 g的BALB/c小鼠，一免兩周后進行采血并二免，二免劑量同第一次免疫劑量。分別在免疫前、一免后2周、二免后2、3、5周采血，通過ELISA方法檢測血清抗體水平，驗證P1的免疫原性。

1.8 MTT試驗測定P1合成表達多肽對外周淋巴細胞的增殖刺激作用

將P1與ISA 201VG佐劑按說明書比例混勻后，免疫斷奶仔豬，2 mL·頭-1，佐劑組僅免疫佐劑，2 mL·頭-1，勃林格疫苗免疫組，1 mL·頭-1，空白對照組免疫滅菌生理鹽水，2 mL·頭-1。免疫5周后分別無菌采集4個組的頸靜脈外周抗凝血，10 mL·頭-1，收集豬血清后，超凈臺內(nèi)分離淋巴細胞，用臺盼藍染色計數(shù)活細胞數(shù)(>95%)，然后用RPMI-1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為5×106mL-1，制成單細胞懸液。

將淋巴細胞懸液加入48孔細胞培養(yǎng)板中，加入PCV2 P1表達多肽純化抗原10 μL(終質量濃度為10 μg·孔-1)，每個樣品平行培養(yǎng)三孔，同時用其他組作為對照，培養(yǎng)體系為每孔1 mL。置5% CO2，37 ℃培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)結束前4 h，每孔取500 μL細胞上清液，-20 ℃保存待檢，余下每孔加入25 μL MTT(初始質量濃度為5 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后，每孔吹打混勻，然后每孔取出200 μL依次加入96孔酶標板中，酶標板中再依次加入100 μL DMSO，置搖床上低速振蕩 10 min，待結晶物充分溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔的OD值(570 nm處)。

1.9 MTT試驗中T細胞分泌的IFN-γ和IL-4的檢測

取上述MTT試驗中，37 ℃培養(yǎng)44 h取樣的細胞上清液，分別用IFN-γ和IL-4的試劑盒檢測外周血淋巴細胞中兩種細胞因子的含量，比較不同試驗組細胞上清液中IFN-γ和IL-4的分泌表達情況。

2 結 果

2.1 P1多肽序列的篩選及優(yōu)化

將篩選的1條含有泛宿主新型Th細胞表位多肽和從PCV2 ORF1、ORF3中篩選的3條Th細胞表位多肽(圖1)與從ORF2中篩選的1條含有多個B細胞抗原表位的多肽序列(圖2)，通過銜接性密碼子進行串聯(lián)，設計插入酶切位點和起始終止密碼子，并對組成的堿基序列進行優(yōu)化，優(yōu)化完成的含有Th細胞表位、B細胞表位以及酶切位點的P1氨基酸序列見圖3。優(yōu)化完成的堿基序列大小為768 bp，預測可表達256個氨基酸。

2.2 優(yōu)化重組后P1多肽序列的密碼子適應指數(shù)分析

作者將序列設計優(yōu)化完成后對氨基酸序列的密碼子偏好性進行了分析。密碼子適應指數(shù)(codon adaptation index，CAI)，常用于基因表達水平的測量。此值為0～1，越接近1表示基因的表達水平越高，當密碼子適應指數(shù)為1.0時，生物體基因可以達到最佳的表達水平。圖4結果表明密碼子適應性指數(shù)為0.89，說明重組優(yōu)化的基因序列可以實現(xiàn)高水平表達。

圖1 從PCV2 ORF1、ORF3中篩選的含有輔助T細胞表位的多肽序列Fig.1 Screening peptide sequences of helper T cell epitopes derived from PCV2 ORF1 and ORF3

圖2 ORF2中篩選的含有多個B細胞表位的多肽序列(47-200 aa)Fig.2 Peptide sequences of B cell epitopes derived from PCV2 ORF2(47-200 aa)

圖3 優(yōu)化完成的重組多肽PCV2 P1氨基酸序列(包含酶切位點和終止密碼子)Fig.3 The optimized amino acid sequence of the recombinant peptide P1 containing restriction enzyme cutting site and terminator codon

圖4 基因序列長度中的密碼子利用頻率分布(CAI，密碼子適應指數(shù))Fig.4 The distribution of codon usage frequency along the length of the gene sequence

2.3 優(yōu)化重組序列的密碼子選擇頻率分析

最優(yōu)密碼子是指在某物種高表達基因中使用頻率最高的密碼子，最優(yōu)密碼子使用頻率(frequency of optimal codons，F(xiàn)OP)可以反映一段基因序列中密碼子在表達過程中的利用情況。由圖5可見，橫坐標中數(shù)值100是指在一個設定的氨基酸序列中密碼子在希望的機體或組織表達過程中的利用頻率的最高值。而作者設計優(yōu)化的序列經(jīng)最優(yōu)密碼子使用頻率分析發(fā)現(xiàn)，有71%的密碼子利用頻率在91%～100%，這說明作者優(yōu)化設計的序列可以實現(xiàn)高水平的表達。

2.4 重組表達質粒的鑒定

將重組后的表達質粒用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，瓊脂糖電泳(圖6)鑒定發(fā)現(xiàn)，目的片段長度與768 bp的理論值相符。

2.5 P1表達后SDS-PAGE鑒定

將構建表達工程菌BL21(DE3)pLysS-pET-30a-P1培養(yǎng)后，用終濃度為1.0 mmol·L-1IPTG進行誘導，誘導表達6 h后收集菌液，進行SDS-PAGE 電泳檢測。由鑒定結果圖7可見，誘導后有兩條蛋白質條帶出現(xiàn)，其中一條為大腸桿菌的本底表達，另一條為目的條帶，大小約為28.29 ku，且目的條帶表達量高于大腸桿菌的本底表達。

圖5 計算機推算的最優(yōu)密碼子的分布頻率(FOP)Fig.5 The percentage distribution of codons in computed codon quality groups

1.重組表達質粒；2.酶切后質粒；M.1 kb DNA相對分子質量標準1.5004538-1 plasmid；2.5004538-1 plasmid digested；M.1 kb ladder圖6 重組表達質粒的NdeⅠ、XhoⅠ酶切鑒定Fig.6 Identification of recombined PCV2-P1 by double enzyme digestion with NdeⅠ and XhoⅠ

2.6 P1免疫原性的Western Blot分析

將誘導表達的P1多肽抗原進行Western Blot分析，以自制純化的PCV2豬高免血清抗體為一抗進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)誘導表達的重組多肽抗原可以與PCV2的高免豬血清發(fā)生特異性反應(圖8)，說明表達產(chǎn)物的抗原性良好。

2.7 小鼠免疫P1多肽抗原后抗體水平檢測

將表達純化的P1多肽抗原按1 μg·mL-1包被酶標板，100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h，4 ℃過夜。次日洗滌3次，每次250 μL·孔-1洗滌液，然后加封閉液150 μL·孔-1，37 ℃封閉孵育1 h，同上方法洗滌后，分別對小鼠在免疫前、一免后2周、二免后2、3、5周的血清進行檢測，由圖9結果可見，免疫后抗體隨免疫時間的增加呈上升趨勢，說明P1多肽抗原可以引起小鼠機體的免疫反應。2.8 MTT試驗測定P1對外周淋巴細胞的增值刺激

M.蛋白質相對分子質量標準；1、3.誘導6 h后樣品；2.誘導4 h后樣品； 4.誘導前樣品M.Protein marker；1，3.Sample after 6 hours’ induction；2.Sample after 4 hours’ induction；4.Sample before induction圖7 重組 P1多肽抗原表達后SDS-PAGE鑒定Fig.7 Identification of the expression of recombinant peptide antigen P1 by SDS-PAGE

M．蛋白質預染相對分子質量標準；1.誘導后表達產(chǎn)物M．Prestained protein marker；1.Expression product after induction圖8 重組 P1多肽抗原表達后Western Blot分析Fig.8 Western Blot analysis of the expressed recombinant peptide antigen P1

分別用表達純化的P1多肽抗原對P1疫苗免疫組、空白對照組進行刺激，并設勃林格疫苗免疫組、佐劑免疫組和空白對照無刺激組作為對照，檢測P1對豬外周血中淋巴細胞的刺激作用。在免疫65 d后采集外周血，每個樣品平行檢測3次，具體檢測結果見表1。另，刺激指數(shù)SI(stimulation index)也可作為判斷淋巴細胞增殖滴度的一個重要指標。用表達純化的P1多肽抗原刺激P1多肽抗原免疫組和空白對照組，并分別設無刺激對照，對SI值進行比較，結果見圖10。

圖9 P1免疫小鼠后抗體水平檢測Fig.9 The antibody level detection of polypeptide antigen P1 in immunized mice

表1 不同免疫組表達多肽P1刺激后淋巴細胞增殖試驗結果

Table 1 The results of lymphocyte proliferation stimulated by peptide P1 to different immunity group

組別Group免疫時間/dImmunizationday樣品數(shù)SamplesOD值ODvalueA、P1免疫+P1刺激P1immunity+P1stimulation6531．2007±0．0119aB、勃林格疫苗免疫+無刺激Boehringervaccineimmunity+nostimulation6530．4123±0．1877cC、空白對照組+P1刺激Black+P1stimulation6530．6780±0．0361bD、佐劑免疫組+無刺激Adjuvantimmunity+nostimulation6530．3460±0．0656dE、空白對照組+無刺激Black+nostimulation6530．3407±0．0674d

同列數(shù)據(jù)后所標字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下表同

Different letters in the same row means significant difference between the treatments(P<0.05)，same letter in the same row means not significant difference between treatments(P>0.05).The same as below

由表1結果可見，A、B、C組與其他各處理試驗組之間差異均顯著(P<0.05)，D組與E組差異不顯著(P>0.05)，這說明佐劑免疫組與空白對照組無差別，經(jīng)表達多肽P1刺激后A、C組的淋巴細胞增值情況較B、D、E組均有顯著性差異(P<0.05)，這說明P1多肽可以有效刺激機體外周血淋巴細胞的增殖；A、C組的差異可以看出同樣經(jīng)P1多肽刺激后，P1多肽免疫組比空白對照組的淋巴細胞增殖能力明顯增強(P<0.05)，說明P1多肽疫苗有較好的刺激機體產(chǎn)生T細胞免疫反應的能力。

淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)：即試驗孔的OD值/對照孔的OD值，可作為反應抗原對淋巴細胞的刺激作用。由圖10結果可見，P1多肽對空白組豬血清中淋巴細胞的刺激指數(shù)大于2.0，對P1多肽抗原免疫組的刺激指數(shù)在3.0以上，說明P1可以有效刺激豬體外周血淋巴細胞的增殖，即可以刺激豬體產(chǎn)生免疫反應。

2.9 T細胞分泌的IFN-γ和IL-4的檢測

IFN-γ、IL-4的檢測結果見表2。

IFN-γ是由T淋巴細胞中的Th1細胞分泌的，可以參與細胞的免疫應答，因此其含量的檢測可以反應機體受到抗原刺激后，細胞免疫應答的水平。多肽P1免疫后的豬外周血液樣本再用P1多肽刺激后，IFN-γ含量(表2)與其他試驗組和空白對照組相比有明顯升高，且差異顯著(P<0.05)，多肽P1免疫組與勃林格疫苗免疫組IFN-γ的產(chǎn)生水平均高于佐劑對照和空白對照組，這說明疫苗免疫后會刺激豬體內(nèi)IFN-γ的表達，而PCV2 P1多肽免疫后，豬體內(nèi)IFN-γ的表達量明顯增加，這可能是由于P1多肽序列中既包含有B細胞抗原表位，又含有輔助Th細胞表位，從而可以更好地激活機體的細胞免疫應答，抵抗PCV2病毒的入侵。

圖10 P1重組多肽抗原刺激對淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)的影響Fig.10 The effect of P1 recombinant peptide antigen stimulating to lymphocyte stimulation index(SI)

表2 T細胞分泌IFN-γ、IL-4的檢測

Table 2 The level of IFN-γ、IL-4 secreted by T cell

組別Group平行數(shù)Parallelnumber平均質量濃度/(pg·mL-1)AverageconcentrationIFN?γIL?4多肽P1免疫+P1多肽刺激P1immunity+P1stimulation370．4108±1．1221a17．4993±0．7152a多肽P1免疫+不刺激P1immunity+nostimulation327．8327±0．4015c12．1113±0．6794b空白對照組+P1多肽刺激Black+P1stimulation349．6751±1．2854b11．5897±0．5941b勃林格疫苗免疫+不刺激Boehringervaccineimmunity+nostimulation328．0214±0．5349c9．5663±0．1723c佐劑免疫對照組+不刺激Adjuvantimmunity+nostimulation37．4554±0．5072d7．3393±0．3243d空白對照組+不刺激Black+nostimulation36．8706±0．1634d6．7923±0．1009d

IL-4是由Th2細胞分泌的，其對機體免疫應答有重要的作用，可以輔助B細胞產(chǎn)生抗體，因此，其含量的高低可影響機體的體液免疫應答的能力。由表2結果可見，多肽P1免疫組和勃林格疫苗免疫組與空白對照和佐劑對照組差異均顯著(P<0.05)，這說明兩種疫苗免疫后均可使機體內(nèi)T細胞分泌IL-4的量大大提高；多肽P1免疫+P1刺激組 IL-4的產(chǎn)生水平高于單獨疫苗免疫組，同時空白對照組在用P1多肽刺激后T細胞分泌IL-4的能力也明顯高于空白對照組，且均差異顯著(P<0.05)，這說明合成表達的P1多肽與傳統(tǒng)疫苗相比，其刺激分泌表達IL-4的量明顯增加，可間接的刺激機體的體液免疫應答，這正是由于其序列中包含的Th細胞表位多肽發(fā)揮的作用。

3 討 論

PCV2感染后容易導致免疫抑制，從而引發(fā)多重感染和復發(fā)感染，造成嚴重的經(jīng)濟損失，PCV2感染所導致的免疫抑制可能是由于Th細胞受到抑制而造成的，有研究發(fā)現(xiàn)，PCV2感染豬的胸腺和扁桃體中的IL-10和IFN-γ mRNA的量均有所增加，而淋巴細胞中IL-2、IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA水平則有所下降[6]，這些細胞因子含量的異常變化表明PCV2可以導致T細胞免疫抑制。臨床預防中主要是采用滅活疫苗和亞單位疫苗免疫。PCV2滅活疫苗存在免疫持續(xù)時間短及病毒培養(yǎng)時滴度難以提高而使免疫成本較高的問題，而亞單位疫苗由于Th表位基因的稀缺而存在不能有效激活機體的免疫反應的缺點，因此近年來的研究多傾向于尋找一種有效地可以增強疫苗免疫效果的佐劑或是研發(fā)新的表位抗原肽疫苗。

吳勝昔等以固相合成法將3個B細胞抗原表位和1個通用型Th細胞表位串連在一起，利用設計合成的豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白新型表位抗原肽免疫小鼠，病毒中和試驗測定結果顯示，該抗體具有較好的免疫保護作用[13]，但該研究中并未進一步測定合成的多肽對機體免疫刺激的影響。本研究中在設計合成的基礎上通過對小鼠和豬的免疫實驗驗證了合成表達的PCV2 Cap P1多肽在刺激機體的細胞免疫和體液免疫方面的作用，并選擇代表性的IFN-γ和IL-4的表達量進行檢測，結果表明外源Th細胞表位多肽的加入可以刺激機體內(nèi)該類細胞因子的表達，使其產(chǎn)量明顯高于機體正常的表達量，從而可以緩解PCV2感染而造成的Th細胞免疫抑制。

IFN-γ是一種由活化的CD4+、CD8+T淋巴細胞和NK細胞產(chǎn)生的細胞因子，它不僅可以提高CTL細胞和NK細胞的靶細胞的能力，也可以誘導細胞表達IL-2受體，L.Genmei等的研究表明，IFN-γ可以顯著增強PCV2疫苗的免疫原性[14]。IL-4是由Th2細胞分泌的細胞因子，具有重要的免疫作用，可以促進B細胞和T細胞的相互作用，輔助B細胞產(chǎn)生抗體，從而促進體液免疫應答[6]。F.Gao等的研究表明，PCV2感染后會引起豬體內(nèi)IL-4含量的降低[15]，因此，在包含刺激這些細胞因子的多肽序列的存在可以明顯提高疫苗的保護力，本研究的試驗結果也證明了這一點。

4 結 論

一種多肽亞單位抗原其免疫原性的強化，可以通過共價鍵耦聯(lián)到有針對性的B細胞表位，即在B細胞表位基礎上針對的增加外源而多樣的Th細胞表位。本研究在前人研究基礎上選取PCV2 Cap蛋白的主要B細胞多肽表位，同時設計加入了4條Th細胞表位多肽，合成表達的PCV2 P1多肽抗原組裝成疫苗，疫苗進入機體后可以有效地激活機體的細胞免疫應答和體液免疫應答，從而大大提高了疫苗的保護力，為后續(xù)其作為疫苗抗原的進一步研究奠定基礎，同時為其他疫病多肽疫苗的研究提供了思路。

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(編輯 白永平)

Expression and Immunogenicity Analysis of PCV2 Cap Recombinant Protein Antigen which Contains Helper T cell Epitope Peptides

CHEN Shan-zhen，ZHAO Yan，LI Zhong-sheng，LUO Jun，CHEN Ke-hong，WANG Gui-ping，LI Qi-chang*

(GuangdongHaidInstituteofAnimalHusbandry&Veterinary，Guangzhou511400，China)

To determine the role of Th cell epitopes，which were screened from PCV2 ORF1，and ORF3，in improving the PCV2 ORF2 Cap P1 immunogenicity when they were added to the sequence，and the feasibility of synthetic expression of PCV2 ORF2 Cap P1 as a vaccine antigen，bioinformatics and molecular biology methods were employed to screen the peptide sequences.A pan-host of T helper cell epitope peptides and three Th cell epitopes peptide sequences of PCV2-specific were identified.These 4 Th cells peptides sequences were combined with a B-cell epitope peptide sequence screened from PCV2 ORF2 Cap1 gene，and then codon was optimized and inserted the restriction sites and stop codons.After analyzing the codon adaptation index and the frequency distribution，predicted it can achieve efficient expression，further chemical synthesis or peptides were carried out.The synthetic polypeptide antigen P1 was connected to the pET-30a expression vector，and transformed into BL21(DE3) pLysS competent cells，the expression in the engineered bacteria BL21(DE3) pLysS-pET-30a-P1 was constructed.The P1 antigen was able to be expressed after IPTG inducting.The expression level was identified by SDS-PAGE，and its biological activity was identified by Western Blot，followed by mice and pigs immunization with P1.Antibody levels in mice and the peripheral blood lymphocyte proliferation in pigs were tested.The results showed that the codon adaptation index of PCV2 P1 sequence was 0.89，it can achieve to high levels of expression，and the peptide fragment is about 28.29 kDa.MTT results showed that P1 peptide antigen had good immunogenicity.In immunized pigs，the expression of IFN-γ and IL-4 can increase obviously，and were significantly different to the control group(P<0.05).These results indicated that P1 could induce a strong humoral and celluar immune response，and it will provide a theoretical basis on PCV2 P1 peptide antigen as a vaccine antigen for further studies.

PCV2；helper T cell epitope peptides；Cap protein

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.020

2015-03-31

廣東省科技計劃星火計劃項目(2012A020603026)

陳善真(1984-)，女，山東安丘人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疫病診斷及疫苗相關研究，E-mail：chensz2@haid.com.cn

*通信作者：李其昌，博士，E-mail：liqc2@haid.com.cn

S852.4

A

0366-6964(2015)12-2273-09