基于ITS與factor 1-alpha序列桉樹焦枯病菌的雙重PCR快速檢測

張 靜，麻文建，朱天輝

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，成都 611130）

桉樹具有生長周期短、易存活、適生范圍廣、輪伐期短、用途多樣化等優(yōu)點(diǎn)，在我國秦嶺淮河以南地區(qū)被大規(guī)模的引種和栽培，尤其以四川、云南、廣東、廣西、福建、湖南、貴州為主要栽培區(qū)［1］。國內(nèi)外目前對桉樹病害的報(bào)道較多，主要以桉樹花斑病（Aureobasidiumsp.）［2］、炭疽病（Colletotrichumgloeosporioides）［3］、紫斑?。⊿eptoriamortarlensis）［4］、灰霉?。˙otrytiscinerea）［5］和桉樹焦枯病［6］等葉部真菌性病害發(fā)生較為普遍，其中由麗赤殼屬（Calonectriade Not）真菌引起的桉樹焦枯病危害最為嚴(yán)重，分布最廣泛［5］。桉樹焦枯病作為一種世界性病害，已成為威脅桉樹的首要病害。桉樹焦枯病主要發(fā)生在桉樹苗木和4年生以下幼樹上。受焦枯病病原菌侵染后，輕者出現(xiàn)桉樹植株葉片脫落，苗圃與幼林落葉、枯梢、枝條萎蔫等癥狀；重者則會(huì)出現(xiàn)感病苗木葉片全部脫落、頂枯、植株枝條全部枯死等現(xiàn)象［7］。在我國引起桉樹焦枯病的麗赤殼屬真菌主要為C.quinqueseptata和C.morganii，而C.morganii主要分布在我國西南地區(qū)。鑒于該病害的嚴(yán)重性及分布的局部性，原林業(yè)部于1996年1月5日把桉樹焦枯病列入國內(nèi)森林植物檢疫對象［8］。

目前，國內(nèi)外對桉樹焦枯病菌的研究主要集中在病原菌形態(tài)學(xué)鑒定、分類、生物學(xué)特性、遺傳性狀、化學(xué)防治等方面，對于桉樹焦枯病菌的快速檢測暫無報(bào)道。因此，建立快速有效的分子生物學(xué)檢測手段具有重要意義。Batuman 等［9］、Henriquez等［10］、Deng 等［11］分別利用PCR 以及基于PCR 的快速檢測技術(shù)對番茄褪綠病毒（Tomatochloroticspotvirus）、菜豆根腐?。‵usariumcuneirostrum）和甘薯褪綠斑病毒（Sweetpotatochloroticfleckvirus）進(jìn)行了有效的前期判斷。本文以引起四川桉樹焦枯病的病原菌（Calonectriamorganii）為對象，建立了基于麗赤殼屬（Calonectria）真菌以及Calonectria morganii病原菌的快速檢測技術(shù)，并成功應(yīng)用于田間不同發(fā)病程度桉樹中病原的檢測，為桉樹焦枯病的早期診斷和提前防治提供重要的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及菌絲的收集

試驗(yàn)所用供試菌株名稱、寄主、來源、數(shù)量詳見表1，其中10號(hào)參試菌株的屬名代表麗赤殼屬（Calonectria）的無性階段。將供試菌分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上，于28 ℃下培養(yǎng)7d后用打孔器在菌落2／3邊緣處打孔，制備直徑為5mm 大小的菌餅，分別轉(zhuǎn)接至瓶裝量為200mL的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）的三角瓶中，置于28℃搖床，140r／min，振蕩培養(yǎng)8d。用滅菌紗布過濾菌絲體，收集菌絲，滅菌蒸餾水沖洗3次，冷凍干燥，存入已滅菌EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試菌株及其來源Table 1 Tested strains and its sources

1.2 供試菌株DNA 提取

供試菌株DNA 的提?。壕z基因組DNA 的提取參照韓振云等［12］的方法。取30mg冷凍干燥的菌絲于研缽中，加液氮后迅速研磨，至菌絲呈白色粉末狀后快速轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，加1mL預(yù)熱的裂解緩沖液混合均勻，置于65 ℃水浴鍋中保溫1h左右；12 000r／min，4℃離心10min，取上清液，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1（體積比）混合有機(jī)溶劑，于12 000r／min，4 ℃再次離心10min，后取上清液；重復(fù)上述步驟2次；最后加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇和1／10體積3mol／L的醋酸鈉溶液，-20 ℃沉淀1h后于12 000r／min，4℃再次離心10min，棄上清液；75%的乙醇沖洗3次，待晾干后加入25μL dd H2O 溶解沉淀；加 入100μL TE（10 mmol／L Tris，1mmol／L EDTA）溶解DNA；吸取5μL DNA 溶液用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，其余DNA樣品置于-20℃冰箱備用。

樣品組織DNA 的提?。涸诮箍莶“l(fā)病期從桉樹栽培園區(qū)內(nèi)采集健康和發(fā)病的葉片組織，用刀切成2cm×2cm 大小的樣塊，75%乙醇消毒后用蒸餾水沖洗3次，晾干，稱取100mg已處理過的新鮮發(fā)病葉片置于研缽中用液氮研磨成粉末，進(jìn)行DNA的提取，后續(xù)提取步驟同上。

1.3 Calonectria屬ITS區(qū)特異性引物設(shè)計(jì)與合成

利用真菌rDNA 基因ITS區(qū)通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對Calonectria屬真菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系（50μL）：10×PCR buffer 5.0μL，25mmol／L的MgCl23μL，10mmol／L dNTP 1.5μL，10mmol／L的引物ITS1／ITS4 各1.5μL，5 U／μLTaq酶0.3μL，模板DNA 4.0μL，加滅菌ddH2O補(bǔ)足體積至50μL，同時(shí)以加ddH2O 代替DNA 模板組做陰性對照。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性40s，56 ℃退火40s，72 ℃延伸45s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL 樣品于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30 min（100V），經(jīng)EB染色后，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。

PCR 產(chǎn)物送往上海生工生物工程公司進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果，結(jié)合GenBank中已知Calonectria屬菌株的ITS 序列，比對后利用軟件Primer Premier 6.0，在Calonectria屬真菌ITS保守區(qū)內(nèi)進(jìn)行該屬特異性引物設(shè)計(jì)，通過基因庫BLAST 比對驗(yàn)證引物的特異性。引物合成委托上海生工有限公司完成。合成的引物序列為：CYS1 5′-CCAGAGGACCCAACAAAC-3′；CYS2 5′-CCAGAGCGAGGTGTATTAC-3′。目的片段擴(kuò)增大小為351bp。

1.4 Calonectria morganii factor 1-alpha（tef1）區(qū)特異性引物的設(shè)計(jì)與合成

利用Calonectria屬真菌factor 1-alpha（tef1）區(qū)基因通用引物，EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）和EF2［5′-GGA（G／A）GTACCAGT（G／C）ATCATGTT-3′］對C.morganii進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系（50μL）：10×PCR buffer 5.0 μL，MgCl23 μL，10 mmol／L dNTPs 1.5μL，EF1-728F（10mmol／μL）1.5μL，EF2（10mmol／μL）1.5μL，Taq聚合酶（5U／μL）0.3μL，ddH2O 33.2μL，模板DNA 4.0μL。PCR反應(yīng)條件：94℃熱啟動(dòng)5min；94℃變性40s；56℃退火40s；72 ℃延伸45s；循環(huán)32 次；72 ℃延伸10min。

PCR 產(chǎn)物送往上海生工生物工程公司進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果，結(jié)合GenBank中已知Calonectria屬菌株的factor 1-alpha（tef1）基因序列，比對后利用軟件Primer Premier 6.0 進(jìn)行C.morganiifactor 1-alpha（tef1）保守區(qū)域內(nèi)的特異性引物設(shè)計(jì)，通過基因庫BLAST 比對驗(yàn)證引物的特異性。引物的合成委托上海生工有限公司完成。合成引物序列為：EF-S-1 5′-GCAAGAGTCGGATGGAAT-3′；EF-A-1 5′-TTGATTGACACTGTGCTAAC-3′，目的片段擴(kuò)增大小為197bp。

1.5 特異性引物的驗(yàn)證

1.5.1Calonectria屬通用引物的特異性驗(yàn)證

用1.3中設(shè)計(jì)合成的引物CYS1／CYS2對參試菌株的基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其特異性。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.3。

1.5.2Calonectriamorganii特異性引物驗(yàn)證

用合成的桉樹焦枯病菌（C.morganii）的特異引物EF-S-1／EF-A-1對參試菌株的基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其特異性，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.4。

1.5.3 雙重PCR 特異性引物驗(yàn)證

利用Calonectri屬真菌特異性引物CYS1／CYS2和桉樹焦枯病原菌（C.morganii）的factor 1-alpha（tef1）基因的特異引物EF-S-1／EF-A-1 進(jìn)行雙重PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50μL）：10×PCR buffer 5.0μL，MgCl23μL，10mmol／L dNTPs 1.5μL，CYS1（10mmol／μL）1.0μL，CYS2（10mmol／μL）1.0μL，EF-S-1（10mmol／μL）1.0μL，EF-A-1（10mmol／μL）1.0μL，Tag聚合酶（5 U／μL）0.3μL，ddH2O 32.2μL，基因組DNA 提取液4.0μL，組成反應(yīng)混合液。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性40s，53 ℃退火35s，72 ℃延伸40s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10min。

PCR 產(chǎn)物的電泳檢測：取5.0μL PCR 產(chǎn)物于含0.5μg／mL EB 的1.5% 瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為9V／cm、時(shí)間為30min，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測并拍照。

1.6 雙重PCR 靈敏度檢測

將桉樹焦枯病原菌（C.morganii）基因組DNA稀釋為450ng／μL、45ng／μL、4.5ng／μL、450pg／μL、45pg／μL、4.5pg／μL、450fg／μL、45fg／μL 濃度梯度，參照1.5.3 的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行雙重PCR 靈敏度檢測。

1.7 田間時(shí)效檢測

2013年6-10 月，在重慶桉樹栽培園區(qū)內(nèi)對不同發(fā)病程度的疑似桉樹焦枯病進(jìn)行隨機(jī)采樣，根據(jù)實(shí)際感病情況對園區(qū)內(nèi)桉樹焦枯病害的感病程度分級處理，共分為初期發(fā)病植株（0～25%）、中期發(fā)病植株（26%～50%）、嚴(yán)重發(fā)病植株（51%～75%）、具有典型癥狀植株（76%～100%）、健康植株（健康葉片）。按照發(fā)病組織DNA 提取方法提取DNA，照1.5.3 所述的方法進(jìn)行雙重PCR 擴(kuò)增，同時(shí)以加ddH2O 代替DNA 模板組和健康組做陰性對照。根據(jù)電泳檢測結(jié)果判定桉樹初期發(fā)病植株、中期發(fā)病植株、嚴(yán)重發(fā)病植株、具有典型癥狀植株、健康植株的樣品中是否攜帶C.morganii致病菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS區(qū)引物的特異性

利用真菌rDNA 基因ITS 區(qū)通用引物對所有供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示：供試的Calonectria屬全部菌株均可擴(kuò)增出1 條351 bp大小的特異性明亮條帶，而對照組無條帶。通過片段回收測序及與已發(fā)表的Calonectria屬序列比對，其結(jié)果顯示同源率為100%，證明特異性引物CYS1／CYS2可以從混合DNA 樣中準(zhǔn)確地檢測出Calonectria屬病菌，準(zhǔn)確率為100%，可以有效地用于Calonectria屬菌株的檢測。

圖1 供試菌株經(jīng)CYS1／CYS2特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of PCR amplification using specific primers CYS1／CYS2

2.2 factor 1-alpha（tef1）區(qū)引物的特異性

桉樹焦枯病病原菌（C.morganii）的特異性引物EF-S-1／EF-A-1對全部供試菌擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示：1～6泳道上的C.morganii均可擴(kuò)增出1條197bp大小的特異性明亮條帶，而對照組無條帶。通過片段回收測序及與已發(fā)表的C.morganii的factor 1-alpha（tef1）基因序列比對，其結(jié)果顯示同源率為100%，證明特異性引物EF-S-1／EF-A-1可以從混合DNA 樣品中準(zhǔn)確地檢測出桉樹焦枯病病原菌（C.morganii），準(zhǔn)確率為100%。表明該引物用于桉樹焦枯病原菌（C.morganii）病害的PCR擴(kuò)增檢測獲得成功。

2.3 雙重PCR 引物的特異性

雙重PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示：1～6泳道上的桉樹焦枯病菌均可擴(kuò)增出2條明亮的特異性條帶，1條197bp，1 條351bp，而Calonectria屬的參試菌有且僅擴(kuò)增出1條351bp大小的明亮條帶，而對照組無條帶。因此，特異性引物CYS1／CYS2和EF-S-1／EF-A-1 雙重PCR 可用于桉樹焦枯病原菌（C.morganii）病害的PCR 特異擴(kuò)增。

圖2 供試菌株經(jīng)EF-S-1／EF-A-1特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The results of PCR amplification using specific primers EF-S-1／EF-A-1

圖3 供試菌株經(jīng)CYS1／CYS2和EF-S-1／EF-A-1雙重PCR 特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The results of duplex PCR amplification using specific primers CYS1／CYS2and EF-S-1／EF-A-1

2.4 雙重PCR 靈敏度檢測

利用引物CYS1／CYS2 和EF-S-1／EF-A-1 組合成雙引物擴(kuò)增桉樹焦枯病原菌（C.morganii），其靈敏度測定結(jié)果（圖4）表明，雙重PCR具有較高檢測靈敏度，可達(dá)到450fg／μL，完全符合田間檢測的要求。

圖4 雙重PCR 靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity detection of duplex PCR

2.5 野外田間時(shí)效性檢測

利用雙重PCR 擴(kuò)增桉樹初期發(fā)病植株、中期發(fā)病植株、嚴(yán)重發(fā)病植株、具有典型癥狀植株、健康植株的樣品DNA，經(jīng)電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果表明：具有典型癥狀植株、嚴(yán)重發(fā)病植株、中期發(fā)病植株、初期發(fā)病植株均可以擴(kuò)增得到分子量為197bp和351bp的2個(gè)片段，則可判定所測植株組織樣品中存在桉樹焦枯病原菌（C.morganii）（圖5），而部分初期發(fā)病植株樣品中沒有擴(kuò)增到條帶，推測其所攜帶的目標(biāo)病菌量未達(dá)到雙重PCR靈敏度檢測的極限。健康植株和陰性對照均沒有擴(kuò)增出條帶，說明本試驗(yàn)不存在污染，具有可靠性。

圖5 雙重PCR 引物檢測田間發(fā)病植株Fig.5 Detection of the filed diseased plant by using duplex PCR

3 結(jié)論與討論

桉樹焦枯病作為一種世界性病害，越來越多地受到人們的重視。加強(qiáng)病害的早期診斷是降低重大病害損失的有效手段。傳統(tǒng)病害的診斷方法主要以形態(tài)學(xué)及生理生化指標(biāo)鑒定為主，該方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力、往往準(zhǔn)確度較低，而且對鑒定者具有很高的專業(yè)知識(shí)要求，此外，肉眼鑒定病害的過程中會(huì)受到多種因素干擾，如分離培養(yǎng)的病原菌是否純化、培養(yǎng)條件的影響、生理指標(biāo)的不穩(wěn)定性等，因此基于傳統(tǒng)方法檢測病害在一定程度上存在弊端。PCR 及基于PCR 的快速診斷技術(shù)在林業(yè)病害上的應(yīng)用彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測的不足，同時(shí)，較高的準(zhǔn)確性、精確性、時(shí)效性使得林業(yè)上多種重要病害的早期診斷成為可能，例如：松材線蟲?。?3］、楊樹潰瘍?。?4］、桉樹青枯?。?5］等。目前，對于桉樹焦枯病的診斷仍停留在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢測上，因此建立桉樹焦枯病的快速檢測技術(shù)十分必要。

國內(nèi)外大量學(xué)者研究證實(shí)，桉樹焦枯病是由多種真菌共同引起的病害，其中Calonectria屬的C.morganii是主要致病菌［16-17］。Crous 等［18-19］發(fā)現(xiàn)C.morganii、Cylindrocladiumclavatum（有性階段為Calonectria屬）、Calonectriacolhounii均是桉樹焦枯病的致病菌，區(qū)別在于其致病力的不同；在印度，侵染桉樹導(dǎo)致焦枯病的Calonectria屬真菌有十幾種，主要以C.quinqueseptata（無性階段為Cylindrocladiumquinqueseptatum）和C.morganii為代表；在阿根廷、巴西、印度、日本、新西蘭C.morganii是主要致病菌；在中國目前已發(fā)現(xiàn)的引起桉樹焦枯病的真菌也有十幾種，主要以C.morganii、C.ilicicola、C.quinqueseptata、Cylindrocladiumclavatum造成的危害較為嚴(yán)重，其中C.morganii和C.quinqueseptata為我國林業(yè)病害的檢疫對象［20］。前期研究發(fā)現(xiàn)，在四川、廣西、福建等地引起桉樹焦枯病的主要致病菌為C.morganii，因此，建立基于Calonectria屬真菌以及C.morganii病原菌的快速檢測對桉樹焦枯病的前期診斷十分必要。

雙重PCR 檢測是在常規(guī)PCR 檢測的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，它主要是以相同或不同的區(qū)域作為靶基因，進(jìn)行兩對特異性引物的設(shè)計(jì)，以改善常規(guī)PCR靈敏度低和易發(fā)生非特異性的缺點(diǎn)［21］。隨著PCR檢測技術(shù)的不斷完善，相信雙重PCR 檢測技術(shù)在多種林木病害上的應(yīng)用也將越來越普遍。同源性高的靶基因序列是檢測病害的前提保障，而特異性極強(qiáng)的保守序列是快速檢測單一種菌株體系構(gòu)建成功的關(guān)鍵因子，Calonectria屬真菌在其ITS序列上同源性較高，可達(dá)到99%，C.morganii病原菌在factor 1-alpha基因上保守性極強(qiáng)，因此選擇兩者作為靶序列是試驗(yàn)成功的理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)基于C.morganii病原菌的ITS和factor 1-alpha基于序列，分別建立了Calonectria屬真菌和桉樹焦枯病菌（C.morganii）的特異性檢測體系，并進(jìn)行了兩對引物共同體系的優(yōu)化和建立，為以Calonectria屬真菌和C.morganii引起的桉樹焦枯病害早期診斷奠定了重要的理論依據(jù)，同時(shí)有關(guān)基于屬與種特異性不同而進(jìn)行靶序列設(shè)計(jì)引物的雙重PCR檢測技術(shù)在國內(nèi)屬于首次報(bào)道。

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