光皮樺成花相關(guān)MADS-box基因BlMADS1的克隆與表達

趙傳慧，周厚君，童再康，林二培，黃華宏，牛明月

光皮樺成花相關(guān)MADS-box基因BlMADS1的克隆與表達

趙傳慧，周厚君，童再康，林二培，黃華宏，牛明月

（浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

MADS-box家族基因廣泛分布于植物中，在花發(fā)育過程中起著重要調(diào)控作用。采用同源克隆結(jié)合cDNA末端快速擴增技術(shù)（RACE）在光皮樺Betula luminifera中克隆到1個MADS-box基因，命名為BlMADS1。該基因可能存在2個不同的轉(zhuǎn)錄本BlMADS1S和BlMADS1L：前者為1 150 bp，編碼254個氨基酸，具有MADS-box基因的典型結(jié)構(gòu)，與歐洲白樺Betula pendula的同源基因相似性最高（97%）；后者長1 312 bp，但僅含有690 bp的開放閱讀框（ORF），編碼229個氨基酸，缺失MADS-box蛋白的C端。這種缺失可能由內(nèi)含子可變剪切造成。同源比對和系統(tǒng)進化分析表明：BlMADS1屬于AP1/SQUA亞家族的AGL79這一分支。定量聚合酶鏈式反應（PCR）表達分析表明：BlMADS1基因在根、莖、葉和花器官中均有表達，但BlMADS1S和BlMADS1L這2個轉(zhuǎn)錄本表達模式存在差異。雄花序發(fā)育過程中，BlMADS1的2個轉(zhuǎn)錄本的表達峰值均在萌動雄花序時期；而在雌花序發(fā)育過程中，BlMADS1L 和BlMADS1S表達水平的峰值分別出現(xiàn)在初生雌花芽和萌動雌花序。圖6表1參27

林木育種學；光皮樺；開花； MADS-box；表達分析

MADS-box基因是一類數(shù)目龐大、高度保守并廣泛分布的基因家族，在植物、動物、酵母等真核生物中都發(fā)現(xiàn)了該類基因的存在［1］。植物MADS-box基因均編碼轉(zhuǎn)錄因子，除了主要參與花、果實等生殖發(fā)育的調(diào)控外，還對根、葉等營養(yǎng)器官的發(fā)育起著重要作用［2－7］。在高等植物中，MADS-box基因編碼蛋白是由高度保守的MADS-box域（M域），較為保守的K域，相對保守的I域和多變的C域組成，屬于MIKC型［8－10］。MADS-box基因及其功能的研究大多集中在擬南芥Arabidopsis thaliana和金魚草Antirrhinum majus等草本模式植中，在林木中的研究較少。目前，僅有楊樹Populus trichocarpa，歐洲白樺Betula pendula，蘋果Malus domestica等少數(shù)幾個樹種上有相關(guān)報道。例如，在歐洲白樺存在3個AP1/ SQUA-like基因BpMADS3，BpMADS4及BpMADS5，它們在雄花序和雌花序發(fā)育過程中大量表達；轉(zhuǎn)基因表明BpMADS4基因能促進蘋果開花［11］，還有助于延緩楊樹衰老和休眠，BpMADS4基因不僅在花序發(fā)育起始階段發(fā)揮重要作用，還參與營養(yǎng)生長向生殖發(fā)育的轉(zhuǎn)變［12］。光皮樺Betula luminifera，屬樺木科Betulaceae樺木屬Betula落葉喬木，是一種用途廣泛的珍貴闊葉用材樹種［13］。光皮樺材質(zhì)優(yōu)良，經(jīng)濟價值高，多數(shù)種質(zhì)童期較短（1.5 a），種內(nèi)具有豐富變異，是優(yōu)良的林木遺傳研究材料。近年來，光皮樺的遺傳改良工作逐漸受到重視［14－16］。然而，對于光皮樺開花相關(guān)基因的功能及其調(diào)控機制研究甚少。本研究以光皮樺無性系植株為材料，克隆光皮樺開花相關(guān)基因BlMADS1，分析其序列特征。通過分析BlMADS1在光皮樺不同器官及不同發(fā)育時期花器官中的表達特性，初步明確了BlMADS1與光皮樺成花間的相關(guān)性。這些研究結(jié)果為利用分子生物學手段調(diào)控光皮樺開花，促進其營養(yǎng)生長，提高木材產(chǎn)量奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以浙江農(nóng)林大學林木良種繁育中心的光皮樺無性系苗（6年生）為試驗材料，1月中旬至3月底按照葉和雌花序、雄花序等器官的不同發(fā)育階段分別取材：幼葉（L1），嫩葉（L2），成熟葉（L3）；萌動雌花芽（FB1），初生雌花芽（FB2），初生雌花序（FI1），發(fā)育雌花序（FI2），成熟雌花序（FI3）；休眠雄花序（MI1），萌動雄花序（MI2），成熟雄花序（MI3）。－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總核糖核酸（RNA）的提取與cDNA合成

植物材料經(jīng)液氮預凍后研磨，以PureLinkTMPlant RNA Reagent（Invitrogen）試劑盒提取總RNA，SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒（Clontech）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于基因克隆和表達分析。

1.3 基因克隆

鑒于光皮樺和歐洲白樺的親緣關(guān)系和MADS-box基因的保守性，根據(jù)歐洲白樺MADS-box家族AP1/ SQUA-like基因（Genbank號為X99653，X99654，X99655）的MADS區(qū)，設(shè)計引物MADS-GSP2進行3′-RACE。根據(jù)獲得的3′-RACE產(chǎn)物序列設(shè)計引物MADS-GSP1進行5′-RACE擴增基因的5′端序列。將cDNA末端快速擴增技術(shù)（RACE）獲得的序列進行拼接，在5′和3′非編碼區(qū)位置，設(shè)計特異引物M1-F和M1-R，進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增基因全長序列。根據(jù)MADS-box基因的結(jié)構(gòu)，設(shè)計特異引物MGF和MG-R，克隆BlMADS1基因3′端部分序列，以驗證其可變剪切是否存在。克隆涉及引物列于表1。RACE采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech），具體的操作過程按照試劑盒說明書進行。全長克隆采用Hifi-taq（TransGen Biotech），聚合酶鏈式反應（PCR）按照試劑說明書進行。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，利用凝膠回收試劑盒（Axygen）進行回收，回收產(chǎn)物連接到載體pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化進入E.coli DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆由南京金斯瑞公司進行序列測定。

1.4 序列分析

采用Vector NTI 11.0（Invitrogen）進行序列拼接和多序列比對。利用Nucleic Tools（http://srs.ebi.ac.uk/ srsbin/cgi-bin/wgetz-page+applSelect）分析推測基因編碼蛋白的氨基酸組成。利用蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域推測工具InterProScan（http://ebi.ac.uk/Tools./InterProScan/）分析其結(jié)構(gòu)域?；跀M南芥，水稻Oryza sativa，楊樹，番茄Solanum lycopersicum的AP1/SQUA-like MADS-box蛋白中MIK區(qū)氨基酸序列，采用MEGA 4.0軟件（鄰接法）進行多序列比較，對光皮樺BlMADS1進行系統(tǒng)進化分析［17］，所用序列來自數(shù)據(jù)庫NCBI（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov）。具體的基因名和序列號參考Shan等［18］的報道。

1.5 實時定量PCR

以光皮樺Actin基因（Genbank號為FJ410442）為內(nèi)參，采用相對定量的方法，對BlMADS1基因2個轉(zhuǎn)錄本的組織表達特性及其在不同器官發(fā)育過程中的表達規(guī)律進行分析。按照SYBR Premix Ex Taq II （TaKaRa）說明書進行定量PCR操作，擴增反應程序為95℃3 min；95℃5 s，60℃10 s，40個循環(huán)。內(nèi)參基因Actin的引物為Actin-Q-F和Actin-Q-R，BlMADS1L的引物為M1-Q-F和M1-Q-R，BlMADS1S的引物為M1-Q-F和M1-Q-R2（表1）。重復3次·試驗-1。

表1 用于基因克隆和表達分析的引物Table 1 Primers used for cloning and expression analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 BlMADS1基因的克隆與序列分析

根據(jù)高度保守的MADS區(qū)設(shè)計簡并引物（MADS-GSP2），用于光皮樺MADS基因3′端序列的分離。以光皮樺莖、葉、花序和根等混合組織的cDNA為模板，進行3′-RACE獲得2個約1 kb的片段，克隆測序表明這2個序列分別長1 099 bp和937 bp，這2個片段僅在靠近3′端的編碼區(qū)存在差異，且差異序列具有典型的內(nèi)含子特征（GT-AG）（圖 1和圖2A）。根據(jù)所得 3′端序列設(shè)計特異引物（MADSGSP1）進行5′-RACE，獲得長約500 bp的片段（圖1），測序拼接獲得長1 284 bp和1 104 bp的2條序列（圖 2）。根據(jù)這些序列，在序列2端設(shè)計特異引物M1-F1和M1-R1擴增到包含完整開放閱讀框（ORF）在內(nèi)的序列，獲得了預期大小的2個片段（圖1），BLAST結(jié)果也顯示這2條序列為MADS-Box基因。這表明在光皮樺中該基因存在2個不同的轉(zhuǎn)錄本，因此將該基因命名為BlMADS1，并將其2個不同的轉(zhuǎn)錄本分別命名為BlMADS1L（長轉(zhuǎn)錄本）和BlMADS1S（短轉(zhuǎn)錄本）。為了驗證BlMADS1L中3′端多余的序列是否為內(nèi)含子，在基因組中是否存在，在這2個轉(zhuǎn)錄本差異區(qū)域的2端設(shè)計引物（MG-F和MG-R），以光皮樺基因組DNA為模板克隆其對應的基因組序列。結(jié)果表明：PCR擴增得到的基因組片段和BlMADS1L轉(zhuǎn)錄本對應片段的序列一致。這說明BlMADS1基因2個轉(zhuǎn)錄本間序列的差異可能是由內(nèi)含子的可變剪切引起的（圖2B）。

圖1 BlMADS1基因PCR產(chǎn)物電泳分析Figure 1 Electrophoresis of PCR products for BlMADS1

圖2 BlMADS1的2個轉(zhuǎn)錄本序列分析Figure 2 Sequence alignment for two transcripts of BlMADS1

2.2 BlMADS1編碼蛋白分析

序列分析表明：BlMADS1S包含 1個 765 bp的開放閱讀框（ORF），編碼 254個氨基酸；而BlMADS1L由于含有未剪切的內(nèi)含子，造成提前終止，僅包含1個690 bp的ORF，編碼229個氨基酸。同源序列比對顯示BlMADS1S/L與歐洲白樺Betula pendula MADS4蛋白相似性最高，分別達97%和85%，而與擬南芥AP1蛋白的相似性則分別為68%和67%（圖3）。 進一步的序列比對表明這2個蛋白均具有典型的MADS-box和K-domain，BlMADS1S編碼的蛋白在C末端具有AP1/SQUA-like MADS-box基因亞家族的特征性paleoAP1 motif，而BlMADS1L編碼的蛋白由于序列提前終止而造成paleoAP1 motif的缺失（圖3）。這些結(jié)果表明：光皮樺BlMADS1基因?qū)儆贏P1/SQUA亞家族，且可變剪切造成的2個不同轉(zhuǎn)錄本編碼不同的蛋白。

2.3 BlMADS1的系統(tǒng)進化分析

已有的研究表明真雙子葉植物AP1/SQUA-like MADS-box在進化中經(jīng)歷了 2次倍增事件（duplication），形成了euAP1，euFUL和AGL79這3個主要分支［15］。為了分析 BlMADS1與其同源基因的進化關(guān)系，選取來自金魚草、擬南芥、歐洲白樺等植物的AP1/SQUA-like同源基因進行系統(tǒng)進化分析。分析結(jié)果顯示：光皮樺BlMADS1屬于 AP1/SQUA-like亞家族AGL79分支，其與同屬的歐洲白樺BlMADS4親緣最近，其次是切花菊Chrysanthemum grandiflorum的CDM41，而與擬南芥的AGL79親緣較遠（圖4）。

圖3 BlMADS1同源比對和序列分析Figure 3 Sequence alignment and analysis of BlMADS1

2.4 BlMADS1基因的表達分析

本研究采用光皮樺Actin基因作為內(nèi)參，對BlMADS1基因2個轉(zhuǎn)錄本的組織表達特性及其在光皮樺不同發(fā)育階段的雄花序、雌花序和葉片（圖5）中的表達規(guī)律進行了分析，結(jié)果如圖6所示。BlMADS1在所有檢測組織中均有表達，但2個轉(zhuǎn)錄本有不同的表達模式。BlMADS1L在雌花芽（FB）和雄花序（MI）中表達量較高，在根中的表達量最低；BlMADS1S在雌雄花序中表達量較高，在莖中表達量最低（圖6A）；在不同發(fā)育階段的花序和葉片中，BlMDAS1L在初生的雌花芽（FB2）中表達量最高，而在其他階段的雌花序中表達量極低，在雄花序中則主要在萌動雄花序（MI-2）中表達，在成熟的雄花序中幾乎不表達；而BlMADS1S的表達高峰分別出現(xiàn)在萌動雄花序（MI-2）和發(fā)育的雌花序（FI-2）（圖6B）；此外，BlMADS1在不同發(fā)育狀態(tài)的葉片中的表達差異不明顯（圖6B）。這些結(jié)果說明：BlMADS1基因在光皮樺雌雄花序萌動成熟的過程中起主要調(diào)控作用，并且還可能與光皮樺雌花序發(fā)育的啟動相關(guān)。

3 討論

MADS-box基因家族是植物中較大的基因家族，序列上具有保守性，結(jié)構(gòu)上也有一定的相似性，但在不同物種甚至不同的組織器官之間，MADS-box基因在功能上存在著很大的差異［19］。目前，雖然在多種植物中均發(fā)現(xiàn)了MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，如在擬南芥中存在100多個MADS-box基因，除少數(shù)幾個MADS-box基因已研究表明在擬南芥花發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，還有超過80%的MADS-box基因功能是未知的［20］。同樣地，在多數(shù)林木中，MADS-box基因的功能仍不明確，其與林木成花或其他發(fā)育過程的相關(guān)性也有待進一步研究。

本研究以童期較短的用材樹種光皮樺為材料，采用同源克隆和RACE的方法從光皮樺中克隆得到了1個MADS-box基因，命名為BlMADS1。序列分析的結(jié)果表明：BlMADS1基因?qū)儆贏P1/SQUA亞家族，且該基因存在2個不同的轉(zhuǎn)錄本，可能是由于3′-端內(nèi)含子的可變剪切造成的。BlMADS1基因的2個轉(zhuǎn)錄本均編碼典型的MADS-box蛋白，具有保守的MADS-box和K-domain，而較長的轉(zhuǎn)錄本由于內(nèi)含子的存在而提前出現(xiàn)終止子，使其編碼的蛋白在C末端缺失其特征性的paleoAP1 motif。類似的可變剪切造成的C末端缺失在其他AP1/SQUA類MADS-box基因也有發(fā)現(xiàn)［15,21－22］。這暗示這種內(nèi)含子的可變剪切可能是AP1/SQUA-like MADS-box基因調(diào)控的方式之一。

圖4 光皮樺BlMADS1編碼蛋白的系統(tǒng)進化分析Figure 4 Phylogentic analysis of BlMADS1 and related AP1/SQUA-like MADS-box genes

MADS-box基因家族在進化中經(jīng)歷了多次復雜事件，其中AP1/SUQA亞家族基因在真雙子葉植物分化前經(jīng)歷了2次倍增事件，形成3個主要分支euAP1，AGL79和euFUL［23］。AGL79和euFUL類基因具有保守的paleoAP1基序（或結(jié)構(gòu)域），被認為是比較原始的類型，但它們之間的進化關(guān)系仍不明確。系統(tǒng)分析結(jié)果表明BlMADS1屬于AGL79這一分支，與同屬的歐洲白樺BlMADS4親緣最近，與切花菊CDM41聚為一類，其次與葡萄Vitis vinifera VFUL-L和金魚草DEF28等具有較近的親緣關(guān)系。同時BlMADS1也具有paleoAP1 motif，說明BlMADS1在進化上屬于較原始的類型。另有研究表明：歐洲白樺BpMADS3，BpMADS4及BpMADS5基因分別是擬南芥AP1/CAL，AGL79及FUL基因的直系同源物［24］。光皮樺BlMADS1基因與歐洲白樺BpMADS4基因具有最近的親緣關(guān)系，說明BlMADS1基因也是擬南芥AGL79基因的直系同源物。

在功能上，許多研究表明AP1/SQUA-like亞家族基因在花器官的起始、萼片及葉片的發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控功能［25－26］。如歐洲白樺BpMADS4基因在雌雄花序分生組織起始的早期階段以及分生組織頂端部位、幼嫩苞片初始部位的表達水平較高，隨著發(fā)育的進行，雄花序和苞片中的表達下降，而雌花序中，表達會持續(xù)至開花后，且種子形成階段主要在胚珠中表達［27］。值得注意的是，可能由于可變剪切，在光皮樺中BlMADS1基因存在2個轉(zhuǎn)錄本，長轉(zhuǎn)錄本BlMADS1L編碼缺失C末端的MADS-box蛋白，短轉(zhuǎn)錄本BlMADS1S則編碼正常的MADS-box蛋白。以往的研究通常認為，這種可變剪切的轉(zhuǎn)錄本會通過降低正常轉(zhuǎn)錄本的濃度，或編碼非正常蛋白，起到抑制正常轉(zhuǎn)錄本功能的作用［15］。本研究的表達分析表明，BlMADS1基因2個轉(zhuǎn)錄本在光皮樺雌雄花序發(fā)育過程中具有的不同表達模式。這2個轉(zhuǎn)錄本均在萌動雄花序中表達量最高，在休眠和成熟的雄花序中的表達水平則降低，這與歐洲白樺BpMADS4基因在雄花序中的表達模式較一致；在雌花序發(fā)育過程中，BlMADS1L的表達最高峰出現(xiàn)在孕育雌花序的花芽中，而BlMADS1S的表達峰值則出現(xiàn)在萌動發(fā)育中的雌花序中，這與BpMADS4基因在雌花序中的表達模式存在差異，暗示BlMADS1L可能在光皮樺雌花序發(fā)育啟動中起抑制作用，而BlMADS1S則可能有促進光皮樺雌花序萌動成熟的功能。這些結(jié)果說明，光皮樺BlMADS1基因2個轉(zhuǎn)錄本的表達可能存在一種協(xié)同關(guān)系，這種協(xié)同作用可能在雌雄花序萌發(fā)成熟過程中起重要的調(diào)控作用。

圖5 不同發(fā)育階段的4種器官Figure 5 Different developing stages of four organs

圖6 BlMADS1基因在不同器官和不同發(fā)育時期組織中的表達分析Figure 6 Expression analysis of BlMADS1 in different organs and tissues from different development stages

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Cloning and expression analysis of a floral related MADS-box gene BlMADS1 from Betula luminifera

ZHAO Chuanhui,ZHOU Houjun,TONG Zaikang,LIN Erpei,HUANG Huahong,NIU Mingyue
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A and F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

As a highly conserved transcription factor family in plants,MADS-box genes play important roles in floral development and regulation of other developmental processes.However,few floral related MADS-box genes have been characterized in Betula luminifera.In this study,a MADS-box gene,BlMADS1,was cloned from Betula luminifera by using homologous cloning and rapid amplification of cDNA ends （RACE）methods. Afterward expression analysis was also conducted.Results of the sequence analysis indicated that BlMADS1 probably had two different transcripts--one was 1 150 bp in length and contained a 765 bp open reading frame （ORF）encoding 254 amino acid residues.This protein was a typical MADS-box protein belonging to the AP1/ SQUA subfamily.The other transcript contained an insertion of 162 bp at the 3′-terminal.The ORF of this transcript was only 690 bp in length encoding 229 amino acid residues with a truncated C terminal,which may have been caused by intron’s alternative splicing.The expression analysis also indicated that BlMADS1 was expressed in all tissues,but showed different expression patterns on its two transcripts during inflorescence development.During male inflorescence development,the highest expression of both these two transcripts was detected in the germinating male inflorescence;whereas,during development of the female inflorescence,thehighest level of BlMADS1L was shown in the germinating female inflorescence buds and the highest level of BlMADS1S was found in the developing female inflorescence.Our study provides basic knowledge about MADS-box genes in Betula luminifera,and will be facilitate further investigation of BlMADS1’s function and regulation mechanism in future.［Ch,6 fig.1 tab.27 ref.］

forest tree breeding;Betula luminifera;flowering;MADS-box;expression analysis

S722.3

A

2095-0756（2015）02-0221-08

浙 江 農(nóng) 林 大 學 學 報，2015，32（2）：221-228

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.02.008

2014-02-20；

2014-03-18

浙江省自然科學基金資助項目（Y3110453）；浙江省農(nóng)業(yè)科技重點項目（2011C12014）；浙江農(nóng)林大學人才啟動項目（2010FR064）；浙江省重點科技創(chuàng)新團隊資助項目（2009R50035-9）

趙傳慧，從事林木遺傳育種研究。E-mail:671469086@qq.com。通信作者：童再康，教授，博士，博士生導師，從事林木遺傳育種研究。E-mail:zktong@zafu.edu.cn