補腎方防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松實驗研究*

范引科 李 雅 姜珊珊 趙 崗 張曉麗 謝人明

陜西中醫(yī)學(xué)院(咸陽 712046)

補腎方防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松實驗研究*

范引科△李 雅▲姜珊珊△趙 崗△張曉麗△謝人明△

陜西中醫(yī)學(xué)院(咸陽 712046)

目的：研究補腎方的抗老年性骨質(zhì)疏松作用機制及抗炎、鎮(zhèn)痛作用。方法：通過老年性骨質(zhì)疏松大鼠模型，觀察骨礦含量、骨代謝生化指標(biāo)血清骨鈣素、尿脫氧吡啶、血清血Ca2+、血P2+水平等指標(biāo)變化。 結(jié)果：補腎方能顯著地提骨礦含量及血清骨鈣素水平，降低尿脫氧吡啶、造模后血清血Ca2+、血P2+;抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹的體積，減少醋酸扭體法引起的扭體次數(shù)。結(jié)論：補腎方能有效對抗老年性骨質(zhì)疏松且有抗炎、鎮(zhèn)痛作用。

隨著老齡化社會的到來，與增齡有關(guān)的骨質(zhì)疏松疾病在全世界常見病、多發(fā)病中已經(jīng)上升到第4位，全世界目前已經(jīng)超過2億病人患有骨質(zhì)疏松，占世界總?cè)丝诘?%[1]。本實驗以去睪丸大鼠骨質(zhì)疏松模型研究補腎方的抗骨質(zhì)疏松作用，并針對其臨床伴隨癥狀(關(guān)節(jié)炎，全身疼痛)進行抗炎、鎮(zhèn)痛作用研究。為進一步開發(fā)新藥、應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠，體重250～270g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。合格證號：醫(yī)動證字：2007—001。KM小白鼠，雌雄兼有，18～22g。購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。合格證號：醫(yī)動字第08-004號。

1.2 實驗儀器 雙能X射線骨密度儀(Prodigy)， Lunar美國通用公司制造；IRIS電偶聯(lián)原子發(fā)射光光度儀 (Advantage Thermo Fisher Scientific)；全自動生化分析儀(Cobas Integra 400)，Roche霍夫曼·羅氏公司制造；YLS-Q4耳腫打耳器，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站生產(chǎn)；精密型電子天平(Satorius BT25S)，北京賽多利斯生產(chǎn)。

1.3 實驗藥品及配制 補腎方為棕褐色粉末，由我院藥物化學(xué)實驗室制備提供； 仙靈骨葆膠囊 (國藥準(zhǔn)字Z20025357，生產(chǎn)批號:080716)；丙酸睪酮注射液(國藥準(zhǔn)字23254H001，生產(chǎn)批號：081003)；阿司匹林(國藥準(zhǔn)字：2003124H7，生產(chǎn)批號：081102)；鹽酸嗎啡注射液(國藥準(zhǔn)字H21021995，生產(chǎn)批號080402)

2 實驗方法

2.1 補腎方對老年性骨質(zhì)疏松大鼠的影響

2.1.1 動物模型建立和分組：SD雄性大鼠行雙側(cè)睪丸切除術(shù)造模。用5%的烏來糖(20mL/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定四肢及頭部于大鼠固定板上，腹中線劍突與恥骨聯(lián)合下1/3段3～4cm處去毛，消毒后沿腹白線逐層打開腹腔，輕推陰囊暴露睪丸，輸精管末端結(jié)扎剪除睪丸(檢查是否完全剪除睪丸)，關(guān)腹縫合消毒。假手術(shù)組，同法手術(shù)暴露睪丸而不切除。術(shù)后肌注青霉素(2萬U/只)，然后分籠飼養(yǎng)，建立切除睪丸致骨質(zhì)疏松模型，正常飲食1周分組。

70只大鼠隨機分為7組：模型組；假手術(shù)組；仙靈骨葆組(模型加仙靈骨葆1500mg/kg·d)；丙酸睪酮組(模型加丙酸睪酮12.5 mg/kg，2次/周)；補腎方小劑量組(模型加補腎方300mg/kg·d)；補腎方中劑量組(模型加加補腎方600mg/kg·d)；補腎方大劑量組(模型加加補腎方1200mg/kg·d)。用藥各組按1mL/100g灌服相應(yīng)藥液，連續(xù)12周。

2.1.2 觀察指標(biāo)和測定方法：給藥結(jié)束后，大鼠用經(jīng)腹腔注射5%的烏來糖(20mL/kg)麻醉后，仰臥位固定四肢及頭部于掃描床上，采用雙能X射線骨密度儀對大鼠骨礦含量進行分析；用代謝籠收集大鼠24h尿液，于-20℃避光保存待檢；麻醉取血，分離血清；測定血Ca2+、血P2+水平；放射兔疫測定法測定血清骨鈣素(s-BGP)；酶聯(lián)兔疫吸附測定法測定尿脫氧吡啶(D-PYD) 水平；以上各指標(biāo)測定均按照試劑盒要求進行。

2.2 補腎方的抗炎實驗(補腎方對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響) KM小鼠60只，隨機分成5組， 12只/組。0.2mL/10g/只/日，連續(xù)給藥7d。灌胃給予下列藥物。對照組：去離子水0.2mL/(10g·d)；陽性對照組：阿司匹林0.30g/(10g·d)；補腎方小劑量組：0.40g/(10g·d)；補腎方中劑量組：0.80g/(10g·d)；補腎方大劑量組：1.60g/(10g·d)。末次給藥后40min后于右耳廊均勻涂抹二甲苯20μL/只,15min后處死沿耳廊基線剪下兩耳，用YLS-Q4耳腫打耳器在左右耳同部位沖下耳片,分別稱重。計算耳廊腫脹度及與對照組比抑制率。

2.3 補腎方的鎮(zhèn)痛實驗(補腎方對醋酸扭體法小鼠扭體次數(shù)的影響) KM小鼠60只，隨機分成5組， 12只/組。0.2mL/10g/只/d，連續(xù)給藥7d。除陽性對照組：鹽酸嗎啡組：0.1g/(10g·d)外，組別、給藥劑量、途徑、容量同2.2。末次給藥后45min腹腔注射0.8%冰醋酸0.1mL/10g，記錄。計算注射后20min內(nèi)扭體次數(shù)及與對照組比抑制率。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨立樣本t檢驗方法進行均值顯著性統(tǒng)計。P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有非常顯著性差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 補腎方對老年性骨質(zhì)疏松大鼠的影響

3.1.1 補腎方對骨質(zhì)疏松大鼠骨礦含量的影響:如表1所示，模型組的骨礦含量均顯著降低；與模型組相比，補腎方中、大劑量顯著增加肱骨、股骨骨礦含量；補腎方、仙靈骨葆、雄性激素組顯著增加全身骨礦含量。

表1 補腎方對骨質(zhì)疏松大鼠骨礦含量的影響

注：與對照組比較，△P<0.01；與模型組比▲P<0.05，◇P<0.01

3.1.2 補腎方對去睪丸所致骨質(zhì)疏松大鼠血清無機離子的影響:如表2所示，與模型組比較，各給藥組大鼠血清血Ca2+血P2+水平有降低的趨勢；補腎方大劑量組、仙靈骨葆、雄激素組可顯著性降低大鼠血Ca2+、血P2+水平。

表2 補腎方對去睪丸所致骨質(zhì)疏松大鼠血清無機離子的影響

注：組間進行t檢驗，與模型組比△P<0.05,▲P<0.01

3.1.3 補腎方對骨質(zhì)疏松大鼠BGP及D-PYD的影響:如表3 所示，與模型組相比，補腎方各組血清骨鈣素水平均有增加的趨勢，補腎方仙大劑量、靈骨葆組、鈣爾奇D組有顯著性差異。補腎方仙中、大劑量、靈骨葆組、雄激素組有顯著性降低骨吸收指標(biāo)尿脫氧吡啶水平。

表3 補腎方對骨質(zhì)疏松大鼠BGP及D-PYD的影響

注：組間進行t檢驗，與模型組比△P<0.05,▲P<0.01

3.2 抗炎實驗(補腎方對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響) 如表4所示,與對照組比，補腎方中、大劑量、阿斯匹林組小鼠耳腫脹度明顯降低，有顯著意義；可提高炎癥抑制百分率。

表4補腎方對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

注：組間進行t檢驗，與對照組比△P<0.05，▲P<0.01

3.3 補腎方的鎮(zhèn)痛實驗(補腎方對醋酸扭體法小鼠扭體次數(shù)的影響) 結(jié)果見表5。與對照組比,補腎方中、大劑量組、鹽酸嗎啡組顯著減少小鼠扭體次數(shù),可提高小鼠與對照組比鎮(zhèn)痛抑制百分率，說明該藥有良好的鎮(zhèn)痛作用。

表5補腎方對醋酸扭體法小鼠扭體次數(shù)的影響

注：組間進行t檢驗，與對照組比△P<0.05，▲P<0.01

4 討 論

本研究中選用6月齡成熟期雄性大鼠切除睪丸復(fù)制老年性骨質(zhì)疏松大鼠模型，結(jié)果表明補腎方能能顯著地提骨礦含量，增加骨形成指標(biāo)血清骨鈣素水平，且不同程度地降低骨吸收指標(biāo)尿脫氧吡啶、造模后血清血Ca2+、血P2+水平；補腎方仙中、大劑量、靈骨葆組、雄激素組顯著性降低骨吸收指標(biāo)尿脫氧吡啶水平。補腎方能抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹的體積，并能減少醋酸扭體法引起的扭體次數(shù)。顯示補腎方具有防治老年性骨質(zhì)疏松的藥理作用。并且針對其臨床伴隨癥狀(關(guān)節(jié)炎，全身疼痛)，補腎方能抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹的體積，并能減少醋酸扭體法引起的扭體次數(shù)，顯示補腎方具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。

臨床用于治療腎虛所致腰膝酸痛，體虛乏力，頭暈耳鳴、失眠多夢等頗有療效[2]。杜仲含有環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類成分，具有抗骨質(zhì)疏松、抗肌肉骨骼老化，促進骨細胞增殖等多種藥理作用。牛膝含有環(huán)烯醚萜苷類、三萜皂苷類成分通過作用于成骨細胞，增加細胞數(shù)量和細胞液中ALP含量；并且抑制破骨細胞活性，進而起到對骨的保護作用。杜仲中總環(huán)烯醚萜苷類成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用；牛膝中以齊墩果酸為苷元的多種三萜皂苷類成分,具有抗炎鎮(zhèn)痛藥理作用[3]。

[1] Leslie,William D,Morin,Suzanne N.Osteoporosis epidemiology 2013: implications for diagnosis,risk assessment,and treatment[J].Current Opinion in Rheumatology,2014,26(4):440-446.

[2] 范引科,李 雅,姜珊珊，等.補腎方治療老年性骨質(zhì)疏松的效應(yīng)機制研究[J].陜西中醫(yī)，2013,34(11)：1563-1564.

[3] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(2010年版)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010:154-155.

(收稿2015-01-22；修回2015-03-10)

*陜西省科技廳課題(2011K16-05-02)

陜西省中醫(yī)藥管理局課題(2009-JC97)

△陜西省中醫(yī)藥研究院(西安710003)

▲陜西省腫瘤醫(yī)院(西安710061)

補腎方 骨質(zhì)疏松 抗炎 鎮(zhèn)痛

R322.1

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.06.058